符小航 符海鴿 賀豐杰 車虹彩 楊鑒冰 崔曉萍

陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（咸陽712046）

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）是指女性在青春期后至四十歲前發(fā)生的非生理性的月經(jīng)停止，伴有潮熱、原發(fā)或繼發(fā)不孕、生殖器萎縮等癥狀的一種婦科內(nèi)分泌性疾?。?］。POF的發(fā)病機(jī)制學(xué)研究表明顆粒細(xì)胞的過度凋亡是導(dǎo)致其發(fā)病的主要病因［2］，中醫(yī)藥在本病的治療去取得了良好的療效，陜西省名中醫(yī)楊鑒冰教授依據(jù)中醫(yī)“腎主生殖”理論，創(chuàng)立了歸腎育宮湯，臨床治療卵巢早衰取得了良好的效果［3－4］。實(shí)驗(yàn)研究表明該方具有調(diào)節(jié)性激素水平的作用，對(duì)免疫學(xué)小鼠POF治療作用顯著［5］，本實(shí)驗(yàn)擬觀察歸腎育宮湯對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡及凋亡調(diào)控基因Bcl－2／Bax蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材 料 1.1 動(dòng) 物 SPF級(jí)雌性昆明小鼠90只，體重（20±5）g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCX（陜）2007－001，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥 物 歸腎育宮湯組方：菟絲子20g，山藥、茯苓、制首烏、雞血藤、焦山楂各15g，枸杞子、川斷各12g，熟地、山萸肉、鹿角霜、紫河車、杜仲各10g，炙甘草6g，所有中藥購于陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)檢驗(yàn)為合格藥物，常規(guī)煎煮，濃縮后備用；結(jié)合雌激素片：美國輝瑞公司，批號(hào)：14040201。

1.3 試 劑 透明帶多肽3（ZP3）：南京金斯瑞生物科技有限公司，批號(hào)：5004321＿2；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑：美國西格瑪生物科技公司；Bcl－2、Bax一抗：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號(hào)：14137200），瑞士羅氏公司。

1.4 儀 器 與 設(shè) 備 圖 像 采 集 系 統(tǒng)：NIKON.ACT－1 DXM1200日本尼康公司；光學(xué)顯微鏡：蔡司光學(xué)儀器（上海）國際貿(mào)易公司。

2 方 法 2.1 卵巢早衰（POF）模型制備 透明帶多肽溶液的配制：按每1.4445mg透明帶多肽粉（ZP3）配1mL三蒸水；免疫試劑和免疫強(qiáng)化試劑的配制：將ZP3溶液分別與弗氏完全佐劑和弗式不完全佐劑按1∶1比例配制成免疫試劑和免疫強(qiáng)化試劑；模型的復(fù)制：分別于第1天和第14天取0.1mL免疫試劑和免疫強(qiáng)化試劑多點(diǎn)注射于小鼠雙后腳掌及腹腔。

2.2 動(dòng)情周期觀察 從免疫試劑注射后第1天起，每天上午用蘸生理鹽水的棉簽放入小鼠陰道，取陰道脫落細(xì)胞，涂片后吉姆薩染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察動(dòng)情周期的變化，若出現(xiàn)動(dòng)情周期的紊亂則表示造模成功。

2.3 分組及給藥 將90只雌性小鼠稱重后按照體重編號(hào)，完全隨機(jī)法分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、雌激素組、歸腎育宮湯大、中、小劑量組，每組15只。雌激素組用結(jié)合雌激素片0.125mg／（kg·d）；各中藥治療組按歸腎育宮湯大劑量組70g／（kg·d）、中劑量組35g／（kg·d）、小劑量組17.5g／（kg·d）灌胃，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，給藥4周。

2.4 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 TUNEL染色按照試劑盒說明書操作，主要操作步驟如下：常規(guī)石蠟切片脫蠟入水→蛋白酶K工作液21～37℃處理組織15min，PBS洗3min，3次→加TUNEL反應(yīng)混合液（含TdT酶和dUTP的標(biāo)記液），置于暗濕盒中37℃標(biāo)記1h→PBS洗5min，5次→加封閉液，置于暗濕盒中37℃反應(yīng)30min→PBS洗5min，5次→加DAB底物，15－25℃反應(yīng)5min，鏡下淺棕色即可→PBS洗5min，5次→光鏡下觀察凋亡細(xì)胞并拍照。用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野結(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征綜合判斷，對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.5 卵泡顆粒細(xì)胞Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)的測定 取小鼠卵巢，常規(guī)切片，脫蠟脫水，3%H2O2室溫孵育5～10min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min x2，5～10%山羊血清封閉，室溫孵育10min，一抗4℃過夜，二抗37℃孵10～30min，滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30min，顯色劑顯色3～15min，沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。采用Zeiss Imerger Al顯微鏡觀察，采用DXM1200FCCD圖像采集系統(tǒng)采集圖片，應(yīng)用Image－Pro Plus5.1圖像分析系統(tǒng)測定其積分光密度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果 3.1 TUNEL法檢測歸腎育宮湯對(duì)卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL標(biāo)記的陽性凋亡結(jié)腸上皮細(xì)胞呈深棕色，正常卵泡顆粒細(xì)胞呈藍(lán)色?？瞻讓?duì)照組小鼠卵泡顆粒細(xì)胞偶見凋亡，模型對(duì)照組小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡顯著增多（P＜0.05），表明由于卵泡顆粒細(xì)胞的過度凋亡最終導(dǎo)致了卵巢功能低下，形成卵巢早衰。結(jié)果見表1。

表1 歸腎育宮湯對(duì)卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)的影響（±s）

表1 歸腎育宮湯對(duì)卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，◇P＜0.05，◆P＜0.01；與雌激素組比較，○P ＜0.05，●P ＜0.01；與大劑量組比較，☆P ＜0.05，★P ＜0.01

組 別 劑量kg·dTUNEL染色凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)）－－ 2.2±1.06模型對(duì)照組 －－ 45.36±4.28▲雌激素組 0.125mg 15.16±3.27◆歸腎育宮湯大劑量組 70g 6.69±3.25◆●歸腎育宮湯中劑量組 35g 10.26±3.57◆○歸腎育宮湯小劑量組 17.5g 18.82±4.41空白對(duì)照組◆★

3.2 歸腎育宮湯對(duì)卵巢早衰小鼠卵泡顆粒細(xì)胞Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)的影響 表明雌激素、歸腎育宮湯大、中、小劑量組藥物可通過調(diào)節(jié)胞Bcl－2和Bax蛋白的表達(dá)對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞的過度凋亡起到抑制作用。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Bcl－2、Bax蛋白積分光密度（IOD）的比較（±s）

表2 各組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞Bcl－2、Bax蛋白積分光密度（IOD）的比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，◇P＜0.05，◆P＜0.01；與雌激素組比較，○P ＜0.05，●P ＜0.01；與大劑量組比較，☆P ＜0.05，★P ＜0.01

－－ 12535.62±892.31 10015.58±895.21模型對(duì)照組 －－ 5043.52±873.17▲ 20153.85±971.86▲雌激素組 0.125mg 7614.57±874.12◆ 17471.16±852.47◆歸腎育宮湯大劑量組 70g 10931.19±941.56◆● 13745.45±837.64◆●歸腎育宮湯中劑量組 35g 9635.26±825.38◆● 13861.32±825.36◆●歸腎育宮湯小劑量組 17.5g 7032.12±802.31◆★ 17985.42±887.56 Bax空白對(duì)照組組 別 劑量（kg·d） Bcl－2◆★

4 討 論 細(xì)胞凋亡是指在一定的生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞接受機(jī)體刺激信號(hào)后出現(xiàn)的一種主動(dòng)的、受凋亡相關(guān)基因控制的細(xì)胞程序性死亡。卵泡顆粒細(xì)胞是維持卵巢功能的主要細(xì)胞，卵泡數(shù)量的多少與卵泡顆粒細(xì)胞密切相關(guān)，卵泡顆粒細(xì)胞的增殖和分化是卵泡不斷發(fā)育至成熟的基本條件，卵泡顆粒細(xì)胞還是是雌激素、孕激素的重要來源，因此它的凋亡引起卵泡數(shù)量減少，激素水平降低并最終導(dǎo)致卵巢早衰的發(fā)生［6］。研究表明，卵巢早衰婦女卵泡數(shù)量急劇減少，不能分泌足夠的激素及生長因子并伴有顯著的卵泡數(shù)量減少，最終導(dǎo)致卵巢早衰。Bcl－2和Bax蛋白在誘導(dǎo)凋亡的線粒體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著重要的作用，Bcl－2蛋白是細(xì)胞凋亡的抑制基因，Bax是Bcl－2的同源蛋白，是一種凋亡誘導(dǎo)基因。Bcl－2和Bax蛋白是抑制細(xì)胞凋亡的重要靶蛋白。歸腎育宮湯是臨床治療卵巢早衰療效確切的方劑，為明確該方是否能通過影響卵巢顆粒細(xì)胞凋亡對(duì)卵巢早衰發(fā)揮治療作用，本實(shí)驗(yàn)采用ZP3溶液多點(diǎn)注射的方式成功復(fù)制了POF小鼠動(dòng)物模型，模型成功后可見卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的明顯增多，經(jīng)給藥治療后，可見歸腎育宮湯大、中、小劑量組小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡顯著減少，與雌激素組比較發(fā)現(xiàn)歸腎育宮湯大、中劑量組藥物療效優(yōu)于雌激素，表明歸腎育宮湯能有效抑制卵泡顆粒細(xì)胞凋亡對(duì)POF起到治療作用。通過對(duì)Bcl－2和Bax蛋白檢測表明，歸腎育宮湯抑制卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制主要與Bcl－2和Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。

［1］ 劉震坤，金 影，董克勤，等.卵巢早衰實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展［J］.吉林中醫(yī)藥，2013，33（7）：754－755.

［2］ 葉 娜，董曉英，李冬華.卵巢早衰的顆粒細(xì)胞凋亡機(jī)制研究進(jìn)展［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（3）：379－383.

［3］ 任潔寧，楊鑒冰.楊鑒冰教授治療卵巢早衰用藥經(jīng)驗(yàn)介紹［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2009，25（3）：1－2.

［4］ 楊鑒冰.補(bǔ)腎育宮湯配合西藥治療卵巢早衰22例［J］.陜西中醫(yī)，2009，30（7）：773－774.

［5］ 符小航，連李斌，康汝光，等.歸腎育宮湯對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠外周血清性激素的影響［J］.陜西中醫(yī)，2014，35（10）：1428－1429.

［6］ 李亞麗，楚 偉，王方娜.何首烏飲對(duì)衰老大鼠卵巢組織凋亡相關(guān)蛋白 Bax／Bcl－2及 Caspase－3表達(dá)的影響［J］.中國新藥雜志，2011，20（18）：1791－1794.