侯吉星 陳良梅 馬新欣 李 璽△ 張露瑩 西安市精神衛(wèi)生中心（西安710061）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是老年期常見(jiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，前期的研究證實(shí)，腦爾康對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的保護(hù)和改善作用，并初步探討了該方改善認(rèn)知的作用機(jī)理［1－4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建AD模型小鼠，觀察復(fù)方中藥腦爾康及其拆方對(duì)慢性鋁中毒AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及對(duì)小鼠皮層、海馬中突觸素（Synaptophysin，SYN），高級(jí)糖基化終產(chǎn)物受體（Receptor for advanced gyration end products，RAGE）的影響，旨在探討中藥抗癡呆的作用機(jī)制，篩選出藥味精簡(jiǎn)，療效相當(dāng)?shù)慕M方，為進(jìn)一步新藥開(kāi)發(fā)精練處方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料 1.1 動(dòng) 物 健康雄性昆明種小鼠70只，體質(zhì)量30±2.8g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（陜）12－004號(hào)。

1.2 藥物與試劑 中藥腦爾康膠囊為院內(nèi)制劑（陜衛(wèi)藥制劑注字920138），全方由人參、黃芪、川芎、丹參、益智仁、生地、菖蒲、冰片等組成。由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥房提供。結(jié)晶三氯化鋁（分析純，AlCl3·6H2O，相對(duì)分子質(zhì)量241.43，天津市津北精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，批號(hào)111123）；抗SYN抗體（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，批號(hào)120815）；SABC免疫組化試劑盒（北京博奧森生物工程有限公司產(chǎn)品，批號(hào)120713）；抗RAGE抗體（北京博奧森生物工程有限公司產(chǎn)品，批號(hào)120602）。

1.3 主要儀器 跳臺(tái)儀（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），臺(tái)式離心機(jī)（上海夏普電器有限公司產(chǎn)品，型號(hào)：WP850A），石蠟切片機(jī)（日本PIKA SEIA公司，型號(hào)：RM－2245），低溫冰箱（日本SANYO公司，醫(yī)用冰箱500型），圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司 型號(hào)：Qwin550CW）。

2 方 法 2.1 藥品、工作液制備 腦爾康濃縮液全方組：人參、川芎、丹參、益智仁、菖蒲各23g，冰片2.3g，熟地、首烏各35g，黃芪70g。按傳統(tǒng)方法水煎，濃縮至257mL，使成每毫升含生藥1g·mL－1，各拆方組生藥量同原方，煎法相同。拆方1號(hào)組：人參、川芎各23g，熟地35g，冰片2.3g；拆方2號(hào)組：黃芪70g，首烏35g，丹參、菖蒲各23g；拆方3號(hào)組：人參、丹參各23g，首烏35g，冰片2.3g；拆方4號(hào)組：人參、丹參、益智仁各23g，冰片2.3g。水煎后均濃縮至257mL，使各拆方組合中生藥濃度與全方中各相應(yīng)生藥濃度相同，115℃ 高壓滅菌20min，備用；結(jié)晶三氯化鋁固體粉末溶于雙蒸水，配制濃度為10g·L－1，0.25μm雙層超濾膜過(guò)濾，待用。

2.2 分組及模型的建立 采用隨機(jī)數(shù)字法將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，按文獻(xiàn)［5］，除空白組外，各組小鼠以AlCl3溶液100mg·kg－1，灌胃，隔日1次，共40d，造成慢性鋁中毒AD模型；空白對(duì)照組用生理鹽水0.2mL灌胃，隔日1次，共40d。

2.3 學(xué)習(xí)記憶成績(jī)測(cè)試 最后一次腹腔AlCl3灌胃30 min后，將小鼠放置于跳臺(tái)儀中，適應(yīng)跳臺(tái)環(huán)境3min，然后將小鼠輕放于平臺(tái)上，當(dāng)小鼠從跳臺(tái)上跳下，接觸跳臺(tái)銅柵時(shí)，立即給予25V電壓刺激，記錄小鼠逃避至平臺(tái)上的時(shí)間（潛伏期），并記錄3min內(nèi)的觸電次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)），以此作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24h后進(jìn)行測(cè)試，將小鼠置于平臺(tái)上，記錄其第一次跳下受電擊的時(shí)間（潛伏期）及3min內(nèi)受電擊的次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)），以此作為記憶成績(jī)。測(cè)試時(shí)若小鼠停留在平臺(tái)上超過(guò)了3 min，其潛伏期以180s計(jì)。

2.4 給藥后學(xué)習(xí)記憶成績(jī)測(cè)試 于學(xué)習(xí)記憶成績(jī)測(cè)試后第二天開(kāi)始給藥。依據(jù)劑量估換計(jì)算公式，全方組及各拆方組每天分別給予相應(yīng)藥物灌胃（14.3g·kg－1·d－1）；空白組和模型組每天給生理鹽水灌胃（0.5mL·d－1），共30d。最后一次給藥30min后，進(jìn)行學(xué)習(xí)成績(jī)測(cè)試，24h后再次測(cè)試記憶成績(jī)。

2.5 SYN，RAGE測(cè)定 測(cè)試結(jié)束后處死小鼠，取右側(cè)腦組織，4%多聚甲醛固定24h，石蠟包埋，石蠟切片機(jī)切片，切片厚度4μm，每張切片含皮層、海馬、齒狀回，每只小鼠取5張切片，4張進(jìn)行免疫組化染色，一張HE染色。免疫組化染色法檢測(cè)各組小鼠皮層和海馬SYN、RAGE表達(dá)水平。

2.6 圖像分析 每組選取對(duì)應(yīng)斷面的切片，采用Image－Pro Plus3.0軟件進(jìn)行圖像采集與分析，檢測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)的平均灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)用±s表示，各組數(shù)據(jù)的均衡性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。各組間差異用單因素方差分析，如滿足方差齊性要求采用LSD法（Least－significant difference，最小顯著差異法）進(jìn)行兩兩比較，如不滿足，則采用Dunnett’T3法。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果 3.1 鋁中毒對(duì)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

與空白組比較，模型組小鼠記憶潛伏期明顯縮短（P＜0.01），學(xué)習(xí)潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）；學(xué)習(xí)與記憶的錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多（P＜0.01），表明用鋁中毒所造成的AD小鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能明顯受損。除空白組外，其余各組間比較，學(xué)習(xí)記憶潛伏期及學(xué)習(xí)記憶錯(cuò)誤次數(shù)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

3.2 腦爾康及其拆方組對(duì)AD模型小鼠腦內(nèi)RAGE表達(dá)的影響 見(jiàn)表1。各用藥組RAGE表達(dá)有不同程度的下降（P＜0.01或P＜0.05），以全方組及拆方1號(hào)組效果最為明顯，且二者拮抗RAGE表達(dá)的效果無(wú)明顯差異，并優(yōu)于拆方2、3、4號(hào)組。

表1 腦爾康及其拆方組對(duì)AD模型小鼠腦內(nèi)RAGE表達(dá)的影響（灰度值）

3.3 腦爾康及其拆方組對(duì)AD模型小鼠腦內(nèi)SYN表達(dá)的 影響 見(jiàn)表2。

表2 腦爾康及各拆方對(duì)AD模型小鼠腦內(nèi)SYN表達(dá)的影響（灰度值）

4 討 論 本課題選用的腦爾康具有益智健腦，活血化瘀，補(bǔ)腎生髓之功效。方中人參、黃芪補(bǔ)中益氣安神為君藥；益智仁、首烏，熟地，健脾補(bǔ)腎生髓共為臣藥；丹參、川芎活血化瘀共為佐藥；菖蒲、冰片，開(kāi)竅醒神共為使藥。組方原則符合中醫(yī)以髓海不足和痰濁內(nèi)阻為AD病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)。本實(shí)驗(yàn)中拆方研究采用君臣佐使化裁法［6］，彌補(bǔ)了以往單純利用數(shù)學(xué)模式進(jìn)行分析的拆方方法，更好的反映出各藥之間的協(xié)同拮抗等配伍關(guān)系。

老年斑主要成分β淀粉樣蛋白（β－amyloid，Aβ）誘發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是AD的主要病理機(jī)制［7］。RAGE屬于細(xì)胞表面免疫球蛋白超家族成員，在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面均有表達(dá)。RAGE不但是Aβ跨血腦屏障內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)的主要受體，還可以和可溶性Aβ單體結(jié)合，造成神經(jīng)元損傷及突觸可塑性降低，在AD的病理中還發(fā)揮主要作用［8－9］。RAGE在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的增加除造成血管系統(tǒng)自身炎癥外，還促進(jìn)Aβ跨血腦屏障內(nèi)流，造成腦組織Aβ沉積及炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步加劇。作者的研究發(fā)現(xiàn)，各用藥組可明顯降低RAGE在海馬和皮質(zhì)的表達(dá)，其中全方組和拆方1號(hào)組作用最為顯著。這提示腦爾康防治AD的機(jī)制之一可能是通過(guò)降低RAGE的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，推測(cè)腦爾康改善AD模型小鼠抗癡呆可能與通過(guò)降低RAGE的表達(dá)從而拮抗Aβ的神經(jīng)毒性作用有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)一個(gè)重要的病理改變是皮質(zhì)和海馬內(nèi)突觸聯(lián)系的丟失。中樞神經(jīng)系統(tǒng)許多功能通路因突觸的丟失而中斷了聯(lián)系，引起多方面的功能障礙，其中最明顯的是認(rèn)知和記憶障礙。突觸素的表達(dá)可以作為突觸前終末的特異性標(biāo)志物，用來(lái)檢測(cè)突觸的密度和分布。作者的研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)突觸素免疫反應(yīng)產(chǎn)物較空白組及各用藥組明顯降低，小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，說(shuō)明突觸素變化對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力具有重要的影響。本研究認(rèn)為突觸素的減少主要是由于鋁選擇性的蓄積在大腦受累的神經(jīng)元，使神經(jīng)元的代謝及蛋白質(zhì)的合成能力受損，同時(shí)軸漿運(yùn)輸減慢，使得軸突終末突觸素合成顯著減少。本實(shí)驗(yàn)中，各用藥組海馬區(qū)和皮質(zhì)突觸素免疫反應(yīng)產(chǎn)物明顯高于模型組，其中全方組和拆方1號(hào)組作用最為顯著，且兩組無(wú)明顯差異。說(shuō)明腦爾康方及拆方1號(hào)組促進(jìn)了海馬區(qū)和皮質(zhì)突觸素表達(dá)，提示拆方1號(hào)及腦爾康改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制，可能是通過(guò)增加突觸素的含量和突觸的數(shù)量促進(jìn)皮質(zhì)和海馬內(nèi)突觸重建和改建發(fā)揮腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)拆方研究對(duì)復(fù)方中藥腦爾康進(jìn)行精簡(jiǎn)，為進(jìn)一步研制出處方更加精煉、效果更加顯著的抗癡呆新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 李 璽，喬成林，張雪飛.腦爾康對(duì)老年癡呆小鼠腦內(nèi)膽堿酯酶活性及神經(jīng)元影響 ［J］.西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，22（2）：17－19.

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