王雪梅，李新鳳，路平，王建明

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801）

玉米絲黑穗病，俗稱“烏米”，是世界各國(guó)玉米生產(chǎn)上的重要病害之一［1］。20世紀(jì)70年代初絲黑穗病已經(jīng)成為我國(guó)春玉米產(chǎn)區(qū)的重要病害，嚴(yán)重威脅著玉米的可持續(xù)生產(chǎn)［2，3］。該病由孢堆黑粉菌（Sporisorium reilianum）侵染引起，是一種苗期侵染成株期發(fā)病的系統(tǒng)侵染性病害。目前生產(chǎn)上還缺乏對(duì)該病菌的早期準(zhǔn)確檢測(cè)措施，而且對(duì)玉米絲黑穗病的抗性鑒定也主要采取田間致病性回接試驗(yàn)，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。開(kāi)發(fā)有效的分子標(biāo)記，從分子水平上研究孢堆黑粉菌的不同致病型遺傳差異，建立快速準(zhǔn)確的玉米絲黑穗病菌室內(nèi)分子檢測(cè)的體系，為該病害的早期準(zhǔn)確診斷、抗病育種及病害防治提供了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列，simple sequence repeat）是由1～6個(gè)核苷酸重復(fù)單元串聯(lián)排列而成的核苷酸序列，廣泛分布于生物基因組內(nèi)［4，5］。根據(jù)不同物種DNA序列中微衛(wèi)星基元種類與長(zhǎng)度差異所產(chǎn)生的多態(tài)性而建立的分子標(biāo)記技術(shù)，即SSR（simple sequence repeat，microsatellite）標(biāo)記，可以快速、有效地分析物種的遺傳差異［6，7］。和其它分子標(biāo)記技術(shù)相比，該技術(shù)具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、技術(shù)簡(jiǎn)單、豐富且遍布基因組等特點(diǎn)［8～11］。目前已廣泛應(yīng)用于基因精細(xì)定位［12，13］、種群遺傳多樣性分析和系譜比較等研究中［14～16］。SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)方法主要有微衛(wèi)星富集法、省略篩庫(kù)法、構(gòu)建和篩選基因組文庫(kù)法和搜索數(shù)據(jù)庫(kù)法等［17］，其中最經(jīng)濟(jì)便捷的方法就是數(shù)據(jù)庫(kù)搜索法，且隨著生物基因組測(cè)序的迅速發(fā)展，基于物種全基因組序列開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)物種SSR標(biāo)記的一種重要方法。

隨著玉米絲黑穗病菌全基因組測(cè)序的完成，基因庫(kù)中已釋放23條染色體基因組序列，本文利用生物信息學(xué)方法搜索玉米絲黑穗病菌基因組第4、5、6、7條染色體序列中的SSR位點(diǎn)，分析其分布規(guī)律與組成特點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行SSR引物的設(shè)計(jì)，為開(kāi)發(fā)絲黑穗病菌基因組SSR標(biāo)記及相關(guān)領(lǐng)域的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

自 NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索孢堆黑粉菌（Sporisorium reilianum）的基因組序列，并以FASTA格式下載孢堆黑粉菌的23條染色體基因組序列，選取其中4條染色體即第4、5、6、7條染色體對(duì)其進(jìn)行分析。

1.2 孢堆黑粉菌基因組SSR的檢索與信息分析

利 用 在 線 軟 件 SSRIT （http：／／www.gramene.org／db／markers／ssrt001）并結(jié)合人工搜索對(duì)孢堆黑粉菌基因組第4、5、6、7條染色體序列中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行搜索，選擇含有2～6堿基且重復(fù)基元長(zhǎng)度≥18bp的基因組序列（二核苷酸重復(fù)次數(shù)≥9，三核苷酸重復(fù)次數(shù)≥6，四核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5，五核苷酸重復(fù)次數(shù)≥4，六核苷酸重復(fù)次數(shù)≥4），然后在此基礎(chǔ)上統(tǒng)計(jì)SSR序列出現(xiàn)頻率與長(zhǎng)度，并分析其組成與分布特點(diǎn)。SSR出現(xiàn)頻率fc＝c／n×100%，c為基元類型的重復(fù)次數(shù)，n為無(wú)冗余SSR數(shù)量。

1.3 基因組SSR引物設(shè)計(jì)

基于孢堆黑粉菌基因組SSR位點(diǎn)（包含其前后兩端各截取的300bp左右序列），利用在線軟件Primer 3.0對(duì)符合條件的SSR序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)主要參數(shù)如下：退火溫度（Tm）為55～65℃，上下游引物的退火溫度相差小于2℃；GC含量在40%～60%；引物長(zhǎng)度為18～25bp之間；預(yù)期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100～500bp之間。

2 結(jié)果與分析

2.1 孢堆黑粉菌基因組SSR信息分析

2.1.1 孢堆黑粉菌SSR的出現(xiàn)頻率

通過(guò)對(duì)孢堆黑粉菌基因組第4、5、6、7條染色體進(jìn)行分析（如表1），共搜索到317個(gè)SSR位點(diǎn)，序列總長(zhǎng)度為6.89kb，占四條染色體基因組堿基數(shù)的0.21%，平均每條染色體大約含有79個(gè)SSR，每10.3kb中就有一個(gè)長(zhǎng)度不小于18bp的SSR序列。此外，各條染色體中SSR數(shù)存在明顯差異，在第4和第7條染色體中，三核苷酸重復(fù)類型最高，二核苷酸次之；而在第5條染色體中，三核苷酸最多，四核苷酸次之；在第6條染色體中，三核苷酸最多，四、五核苷酸次之?？偟膩?lái)說(shuō)，這4條染色體中，三核苷酸重復(fù)類型的SSR數(shù)最多。

由表2可以看出，在檢索到的孢堆黑粉菌SSR中，二至六核苷酸重復(fù)類型均存在，但出現(xiàn)數(shù)量和頻率存在明顯差異。其中三核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率最高，共171個(gè)，占總SSR的53.94%，出現(xiàn)頻率達(dá)2.42%。其它各類核苷酸重復(fù)類型的出現(xiàn)頻率均小于1.00%。

2.1.2 孢堆黑粉菌SSR重復(fù)基元組成與分布

通過(guò)對(duì)孢堆黑粉菌SSR中重復(fù)基元類型與分布特點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，二核苷酸重復(fù)類型中，主要的重復(fù)基元類型為（GA／TC）n，共有20個(gè)，占全部 SSR 的比例為39.22%，其次為（AG／CT）n，共有18個(gè)（35.29%），其余各重復(fù)基序類型的數(shù)量都小于10個(gè)；三核苷酸重復(fù)類型中，出現(xiàn)最多的重復(fù)基序類型為（GCA／TGC）n、（AGC／GCT）n和（CAG／CTG）n，分別為42個(gè)（24.56%）、27個(gè)（15.79%）和26個(gè)（15.20%），其余各重復(fù)基序的數(shù)量均小于20個(gè)；在四、五、六核苷酸重復(fù)類型中，除（ACGC／GCGT）n和（GCCA）n，其余各重復(fù)基序類型占所有SSR的比例均小于10%?？梢?jiàn)，每種重復(fù)基元的出現(xiàn)頻率各不相同，出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)基序類型為（GCA／TGC）n，高達(dá)13.25%，其次是（AGC／GCT）n和（CAG／CTG）n，分別為8.52%、8.20%。其他各類重復(fù)基元的出現(xiàn)頻率均在0.3%～6.5%之間。

表1 孢堆黑粉菌不同染色體的SSR數(shù)量分布表Table 1 The distribution sheet of SSR number in different chromosomes of Sporisorium reilianum

表2 孢堆黑粉菌基因組SSR數(shù)量與比例Table 2 Number and percentage of SSR inSporisorium reilianum

表3 孢堆黑粉菌中SSR主要重復(fù)基元類型及比例Table 3 The motifs and their percentages inSporisorium reilianumSSRs

續(xù)表3

2.1.3 孢堆黑粉菌基因組SSR中基元重復(fù)次數(shù)和長(zhǎng)度

孢堆黑粉菌SSR中基元重復(fù)次數(shù)的分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表中可以看出，以重復(fù)基元的最低重復(fù)次數(shù)為4的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)孢堆黑粉菌基因組SSR進(jìn)行檢索，共獲得15種重復(fù)次數(shù)，其中重復(fù)基元的最高重復(fù)次數(shù)為23次。重復(fù)次數(shù)為6次時(shí)獲得的SSR數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的26.18%，其次為7次重復(fù)，占SSR總數(shù)的18.30%。其中三核甘酸重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)最多（23次）；其次是二核苷酸重復(fù)序列（22次），五核苷酸重復(fù)次數(shù)最少，只有8次。此外，由表4還可以得出，在孢堆黑粉菌基因組的這4條染色體中，共搜索到317個(gè)SSR位點(diǎn)，其中三核苷酸重復(fù)序列出現(xiàn)頻率最高，共171個(gè)，其次為二核甘酸重復(fù)序列，數(shù)量為51個(gè)，這兩種SSR共計(jì)222個(gè)，占SSR總數(shù)的70.03%；六核甘酸重復(fù)最少為17個(gè)，四核苷酸和五核苷酸重復(fù)序列數(shù)量相差不大。

2.2 孢堆黑粉菌基因組SSR引物設(shè)計(jì)

基于孢堆黑粉菌基因組序列，利用Primer3.0在線軟件共設(shè)計(jì)SSR引物40對(duì)。引物信息見(jiàn)表5。S之前的數(shù)字表示染色體編號(hào)，之后的數(shù)字表示引物設(shè)計(jì)序號(hào)。

表4 孢堆黑粉菌基因組中SSR組成與頻率分布Table 4 Number of repeat occurred in Genomic－SSR of Sporisorium reilianum

表5 孢堆黑粉菌基因組SSR引物信息Table 5 Characteristics of Genomic－SSR primers designed forSporisorium reilianum

續(xù)表5

續(xù)表5

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)孢堆黑粉菌第4、5、6、7條染色體基因組進(jìn)行SSR信息分析，在一定程度上反映了該病菌基因組中SSR的組成、分布與密度，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)SSR引物，結(jié)果表明，SSR位點(diǎn)占這4條染色體基因組總長(zhǎng)的0.21%，平均10.3kb中就分布有一個(gè)長(zhǎng)度大于18bp的SSR序列。其次該SSR分布具有短重復(fù)核苷酸基序更為豐富的特點(diǎn)，三核苷酸重復(fù)和二核苷酸重復(fù)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；而長(zhǎng)重復(fù)核苷酸基序的數(shù)量比短重復(fù)核苷酸基序的數(shù)量少，尤以六核苷酸重復(fù)的數(shù)量最少。這一結(jié)果為開(kāi)發(fā)孢堆黑粉菌SSR引物及進(jìn)行玉米絲黑穗病菌遺傳學(xué)研究提供了可靠的理論依據(jù)。

在禾谷鐮刀菌基因組中，SSR序列占基因組全長(zhǎng)的0.27%，平均7.7kb堿基中有一個(gè)大于15 bp的SSR序列，而且長(zhǎng)重復(fù)堿基基序更為豐富，數(shù)量最多的是五堿基重復(fù)序列，其次是六堿基重復(fù)序列，而數(shù)量最少的則是二核苷酸重復(fù)序列；［12］而在稻瘟病菌基因組中，SSR序列約占整個(gè)基因組全長(zhǎng)的0.85%，平均2.36kb堿基中就分布有1個(gè)SSR序列，數(shù)量最多的是單堿基重復(fù)序列，其次為三堿基重復(fù)序列和五堿基重復(fù)序列。［12］由此可見(jiàn)，在不同真菌中其SSR組成存在著很大的差異。造成這種差異的原因可能有兩種：其一，可能是不同研究人員對(duì)SSR最低長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)等參數(shù)的設(shè)置不同，或數(shù)據(jù)庫(kù)中的染色體基因組數(shù)量差異造成。其二，可能是由于物種的真實(shí)SSR信息差異所致。

近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的物種全基因序列被釋放出來(lái)，使得人們基于物種的全基因組序列開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記成為可能。Suga H、Naef A、Saharana M S、Scott J B等基于Fusarium graminearum基因組DNA（gDNA）開(kāi)發(fā)了46對(duì)可用于禾谷鐮刀菌種內(nèi)、近緣種間或引起赤霉病的幾種鐮刀菌間遺傳多樣性分析的SSR引物［18～21］。國(guó)內(nèi)任旭等［22］基于 Fusarium verticillioides基因組DNA開(kāi)發(fā)了22對(duì)可用于輪枝鐮刀菌遺傳多樣性分析的引物。徐靜靜等［23］基于大豆疫霉菌基因組開(kāi)發(fā)了12對(duì)可用于大豆疫霉菌遺傳多樣性分析的SSR 引物。目前，NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）數(shù)據(jù)庫(kù)中，已經(jīng)公布了玉米絲黑穗病菌23條染色體基因組序列，但未見(jiàn)有關(guān)該病菌Genomic－SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用方面的報(bào)道，因此玉米絲黑穗病菌Genomic－SSR標(biāo)記還有很大的挖掘潛力。

本研究基于玉米絲黑穗病菌的全基因組序列，利用生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)其基因組SSR序列進(jìn)行搜索和分析，在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)Genomic－SSR引物，為進(jìn)一步建立玉米絲黑穗病菌Genomic－SSR標(biāo)記和探索其在玉米絲黑穗病菌基因組學(xué)研究中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

［1］王曉鳴，晉齊鳴，石潔，等.玉米病害發(fā)生現(xiàn)狀與推廣品種抗性對(duì)未來(lái)病害發(fā)展的影響［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2006，36（1）：1－11.

［2］晉齊鳴，王曉鳴，王作英，等.東北春玉米區(qū)玉米絲黑穗病大發(fā)生原因及對(duì)策［J］.玉米科學(xué)，2003，11（1）：86－87.

［3］馬軍韜，王殿修，宮秀杰，等.6省區(qū)玉米絲黑穗病菌遺傳多樣性分析［J］.玉米科學(xué)，2008，16（6）：58－63.

［4］Tautz D，Renz M.Simple sequence repeats are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes［J］.Nucleic Acids Research，1984，12：4127－4138.

［5］Field D，Wills C.Abundant microsatellite polymorphism in Saccharomyces Cerevisiae and the different distributions of microsatellites in eight prokaryotes and S.cerevisiae，result from strong mutation pressures and a variety of selective forces［J］.Proceeding National Academy of Sciences U S A，1998，95（4）：1647－1652.

［6］Cho Y G，Ishii T，Temnykh S，et al.Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GenBank sequences in rice（Oryza sativa L.）［J］.Theoretical and Applied Genetics，2000，100：713－722

［7］Katti M V，Ranjekar P K，Grpta V D.Differential distribution of simple sequence repeats in eukaryotic genome sequences［J］.Molecular Biology and Evolution，2001，18：1161－1167.

［8］曹恒春，王毅，黃莉莎，等.可可全基因組SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及分析［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，44（3）：340－344.

［9］關(guān)玲，章鎮(zhèn)，王新衛(wèi)，等.蘋果基因組SSR位點(diǎn)分析與應(yīng)用［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（21）：4415－4428.

［10］高亞梅，韓毅強(qiáng)，湯輝，等.根瘤菌基因組內(nèi)簡(jiǎn)單重復(fù)序列的分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（10）：2992－2998.

［11］張小飛，高增貴，莊敬華，等.利用 UP－PCR、ISSR和 AFLP標(biāo)記分析玉米絲黑穗病菌遺傳多樣性［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2010，37（3）：241－248.

［12］李成云，李進(jìn)斌，劉林，等.禾谷鐮刀菌和稻瘟病菌基因組中的微衛(wèi)星序列比較［J］.植物保護(hù) 學(xué)報(bào).2005，32（3）：251－255.

［13］Jiang Y B，Jie Y C，Zhou J L.et，al.Isolation and characterization of micro－satellites from ramie［Boehmeria nivea（L.）Gaud.］［J］.Acta Agronomical Sinica，2007，33（1）：158－162.

［14］Levinson G，Gutman G A.Slipped－strand mispairing：a major mechanism for DNA sequence evolution［J］.Molecular Biology and Evolution，1987，4（3）：203－221.

［15］Goulao L，Oliveira C M.Molecular characterization of cultivars of apple（Malus×domestica Borkh.）using microsatellite（SSR and ISSR）markers［J］.Euphytica，2001，122：81－89.

［16］Gianfranceschi L，Seglias N，Tarchini R，et al.Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple［J］.Theoretical and Applied Genetics，1998.96：1069－1076.

［17］李明芳，鄭學(xué)勤.開(kāi)發(fā)SSR引物方法之研究動(dòng)態(tài)［J］.遺傳 HEREDITAS（Beijing），2004，26（5）：769－776.

［18］Suga H，Gale LR，and Kistler HC.Development of VNTR markers for two Fusarium Graminearum clade species［J］.Molecular Ecology，2004，4（3）：468－470.

［19］Naef A，Senatore M，Defago G.A microsatellite based method for quantification of fungi in decomposing plant material elucidates the role of Fusarium graminearum DON production in the saprophytic competition with Trichoderma atroviride in maize tissue microcosms［J］.FEMS Microbiology.Ecology，2006，55，211－220.

［20］Saharana M S，Naef A.Detection of genetic variation among Indian wheat head scab pathogens（Fusarium spp.／isolates）with microsatellite markers［J］.Crop Protection，2008，27（7）：1148－1154.

［21］Scott J B，Chakraborty S.Identification of 11polymorphic simple sequence repeat loci in the phytopathogenic fungus Fusarium pseudograminearum as a tool for genetic studies［J］.Molecular Ecology Resources，2008，8（3）：628－630.

［22］任旭，朱振東，李洪杰，等.輪枝鐮孢SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及在玉米分離群體遺傳多樣性分析中的應(yīng)用［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（1）：52－66.

［23］徐靜靜，王曉鳴，武小菲，等.大豆疫霉多態(tài)性SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)及遺傳多樣性分析［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2009，39（4）：337－346.