★ 徐鳳蓮 張啟云 彭國(guó)梅 姚蓉 李冰濤 徐國(guó)良 (江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心 南昌330004)

附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeliDebx.)的子根的加工品。性大熱，味辛;入心經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng);具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒除濕之功效等［1］。臨床用于治療陰盛格陽(yáng)，大汗亡陽(yáng)，風(fēng)寒濕痹等疾病。附子屬于毒性藥材，臨床常用其炮制品，炮制過(guò)程中雙酯型生物堿水解成單酯型生物堿，毒性顯著降低等［2］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)附子成分的研究已相當(dāng)?shù)某墒?，但是全面解析黑順片化學(xué)成分的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)采用UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對(duì)黑順片的化學(xué)成分進(jìn)行全面的分析。該技術(shù)結(jié)合了超高效超高效液相的高分離度和四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜的高分辨率、高靈敏度。UHPLC能為復(fù)雜的樣品提供快速有效的色譜分離;Q-TOF/MS提供精確的分子量和同位素峰度等相關(guān)信息，擬合出最適元素組成(誤差控制在5ppm以內(nèi))，結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片信息，比對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)，推測(cè)其可能的結(jié)構(gòu)，確定峰歸屬。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1290系列超高效液相色譜儀(Agilent)，6538A四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent)，Milli-Q Advantage A10(Millipore);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廈門精藝興業(yè)科技有限公司);KDM型調(diào)溫電熱套(鄄城華魯電熱儀器有限公司)。

1.2 試藥 本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自四川省維克奇生物科技有限公司:烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):130723)，新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):130402)，次烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):130509)，苯甲酰烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):130316)，苯甲酰新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):130505)，苯甲酰次烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):130401)，黑順片(原產(chǎn)地四川;產(chǎn)品批號(hào):1201001);甲醇(色譜純，Tedia);乙腈(色譜準(zhǔn)，Tedia);甲酸(色譜純，Sigma);水為超純水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 混標(biāo)溶液的制備 分別稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿對(duì)照品約5mg，精密稱定，加甲醇定容到10mL容量瓶中，作為混標(biāo)溶液儲(chǔ)備液。將上述儲(chǔ)備液稀釋100倍，即得混標(biāo)溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 黑順片500g，置1000mL圓底燒瓶中，加入8倍量(m/v)水回流提取3次，每次1.5h，提取液濃縮至每1mL相當(dāng)于2g黑順片原藥材。將上述的黑順片提取液用純水稀釋50倍，即得黑順片供試品溶液。

2.2 液質(zhì)聯(lián)用條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Poroshell 120 EC-C18柱(3.0mm×100mm，2.7μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相A:0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B:乙腈，梯度洗脫程序?yàn)?～4min，5%B;4～6min，5%～8%B;6～15min，8%～18%B;15～20min，18%～26%B;20～28 min，26%～45%B;28～35min，45%～95%B;流速:0.4mL/min;進(jìn)樣量:2μL。

表1 黑順片水提液中各成分MS2碎片的相關(guān)信息

注:S經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證。

2.2.2 質(zhì)譜條件 正離子掃描;掃描范圍:100～1000Da;離子源:雙電噴霧離子源;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流速:10L/min;噴霧室壓力:40psig;毛細(xì)管電壓:4 000V;毛細(xì)管出口電壓:120V;錐孔電壓:65V。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣2μL，計(jì)算五個(gè)主要色譜峰面積的RSD值，分別為2.91%、2.92%、1.23%、2.41%、1.50 %。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，24h進(jìn)樣檢測(cè)，每次進(jìn)樣2μL，計(jì)算五個(gè)主要色譜峰面積的RSD值分別為3.43%、3.41%、1.78%、4.05%、0.97%。結(jié)果表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 黑順片水提液按照"2.1"項(xiàng)目下稀釋方法平行6個(gè)樣本，依次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣2μL，計(jì)算五個(gè)主要色譜峰面積的RSD值，分別為1.51%、2.07%、1.88%、1.53%、1.44%。表明，方法的重復(fù)性較好。

3 結(jié)果與討論

3.1 黑順片成分的快速鑒定 黑順片中生物堿類成分在Duel ESI正離子模式下獲得了良好的響應(yīng)，其總離子流圖見(jiàn)圖1，在35 min內(nèi)各個(gè)成分得到良好的分離。本實(shí)驗(yàn)采用Masshunter工作站分析處理數(shù)據(jù)，對(duì)比PCDL數(shù)據(jù)庫(kù)、Chemspider等網(wǎng)站和相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定了黑順片中70種成分，包括雙酯型生物堿(DDAs)4種，單酯型生物堿(MDAs)22種，醇胺型生物堿(ADAs)23種，脂型生物堿(LDAs)4種，其他類型17種(見(jiàn)表1)。

圖1 黑順片提取液總離子流圖

3.2 確認(rèn)峰歸屬 C19-二萜類生物堿根據(jù)C-8和C-14位取代基的不同主要分為雙酯型生物堿、單酯型生物堿、醇胺型生物堿和脂型生物堿。

P64的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明［M+H］+為m/z 616.311 0，Masshunter工作站擬合其化學(xué)組成為C33H45NO10，誤差為-0.81 ppm，初步推斷P64為次烏頭堿(Hypaconitine，HAC)。二級(jí)圖譜中碎片離子有m/z 584.289 5［MH-CH3OH?+，m/z 556.289 5［MH-CH3COOH］+，m/z 524.263 6［MHCH3COOH-CH3OH］+，m/z 496.267 8［MHCH3COOH-CH3OH-CO］+，m/z 492.237 0［MHCH3COOH-2CH3OH］+，m/z 464.242 2［MHCH3COOH-2CH3OH-CO］+，m/z 460.210 8［MH-CH3COOH-3CH3OH］+，m/z 432.217 0［MHCH3COOH-3CH3OH-CO］+，m/z 402.226 9［MH-CH3COOH-CH3OH-BzOH］+，m/z 370.200 5［MH-CH3COOH-2CH3OH-BzOH］+，m/z 338.174 6［MH-CH3COOH-3CH3OH-BzOH］+，其裂解途徑見(jiàn)圖2。參照標(biāo)準(zhǔn)品及相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)等［5-6］鑒定該化合物為HA。

圖2 次烏頭堿裂解途徑

圖3 Benzoylmesaconitine和Circinasine B結(jié)構(gòu)式

圖4 苯甲酰新烏頭堿裂解途徑

LDAs和DDAs的區(qū)別在C-8位取代基不同，前者為脂肪酰基取代，后者為乙?；〈?。因此，其裂解規(guī)律類似等［3-4］。同理，共鑒定出4個(gè)DDAs型和4個(gè)LDAs型化合物。

P42的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明［M+H］+為m/z 590.295 9，Masshunter工作站擬合其化學(xué)組成為C31H43NO10，誤差為-0.17 ppm，初步推斷P42為苯甲酰新烏頭原堿或Circinasine B(見(jiàn)圖3)。二級(jí)圖譜中碎片離子有m/z 572.284 6［MH-H2O］+，m/z 558.269 3［MH-CH3OH］+，m/z 540.259 0［MHCH3OH- H2O］+，m/z 526.243 0［MH -2CH3OH］+，m/z 508.232 5［MH-2CH3OHH2O］+，m/z 494.216 6［MH-3CH3OH］+，m/z 476.206 1［MH-3CH3OH-H2O］+，其裂解途徑見(jiàn)圖4。參照標(biāo)準(zhǔn)品及相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定該化合物為BMA。同理，共鑒定出22個(gè)MDAs型化合物。

圖5 Fuziline、Delcosine和Potanine結(jié)構(gòu)式

圖6 附子靈裂解途徑

P20的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明［M+H］+為m/z 454.279 8，Masshunter工作站擬合其化學(xué)組成為C24H39NO7，誤差為0.66 ppm，初步推斷P20為Fuziline/Delcosine/Potanine(見(jiàn)圖5)。二級(jí)圖譜中碎片離子有m/z 436.269 4［MH-H2O］+，m/z 418.257 9［MH-2H2O］+，m/z 404.243 4［MH-CH3OHH2O］+，m/z 386.231 9［MH-CH3OH-2H2O］+，m/z 376.211 5［MH-CH3OH-H2O-C2H4］+，m/z 372.216 8［MH-2CH3OH-H2O］+，m/z 358.201 0［MH-3CH3OH］+，m/z 354.205 1［MH-2CH3OH-2H2O?+，m/z 344.185 2［MH-2CH3OH-H2O-C2H4］+，其裂解途徑見(jiàn)圖6。參照相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)［5］鑒定該化合物為Fuziline。同理，可鑒定出ADAs型化合物23個(gè)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)全面解析黑順片中生物堿類化學(xué)成分，初步鑒定出黑順片提取液中70個(gè)化合物。此外，在全掃描模式中檢測(cè)到了烏頭堿和新烏頭堿，由于含量少，并未打出二級(jí)質(zhì)譜圖。通過(guò)對(duì)照品對(duì)比，RT與m/z均一致，故初步推測(cè)黑順片藥材中存在極微量的烏頭堿和新烏頭堿。本實(shí)驗(yàn)較全面的解析了黑順片的化學(xué)成分，豐富了對(duì)黑順片中化學(xué)物質(zhì)的認(rèn)識(shí)，為黑順片藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

［1］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典·一部［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］郭志勇，呂永磊，許曉嘉，等.炮制對(duì)烏頭各部位水煎液中生物堿的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32(08):1 867-1 870.

［3］Wang Y，Shi L，Song F，et al.Exploring the ester-exchange reactions of diester-diterpenoid alkaloids in the aconite decoction process by electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2003，17(4):279-284.

［4］Liu W，Pi Z，Wang X，et al.HPLC/ESI-MSn and ESI-MSstudies on the Aconitum alkaloids in three Chinese medicinal herbs［J］.J Sep Sci，2010，33(17-18):2 898-2 906.

［5］Hu R，Zhao J，Qi L，et al.Structural characterization and identification of C19-and C20-diterpenoid alkaloids in roots ofAconitum carmichaeliby rapid-resolution liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2009，23(11):1 619-1 635.

［6］Wang Y，Liu Z，Song F，et al.Electrospray ionization tandem mass spectrometric study of the aconitines in the roots of aconite［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2002，16(22):2 075-2 082.