張 雪，周 英，管 靜，鄢守群，俸婷婷*

(1.貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025;2.貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽 550025;3.貴州省藥食同源植物資源研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxialse，XOD)是一種黃素蛋白酶，主要分布于肝臟和腎臟。黃嘌呤氧化酶既能催化黃嘌呤生成次黃嘌呤，也能催化次黃嘌呤生成尿酸，因此，當(dāng)人體攝入嘌呤類食物過多，或黃嘌呤氧化酶活性增強(qiáng)，嘌呤代謝紊亂時(shí)，體內(nèi)尿酸濃度就會(huì)升高，形成高尿酸血癥。尿酸濃度過高，易在關(guān)節(jié)處沉積形成結(jié)晶造成痛風(fēng)。因此，抑制黃嘌呤氧化酶的活性是減少尿酸的產(chǎn)生，治療痛風(fēng)的關(guān)鍵。別嘌呤醇是典型的黃嘌呤氧化酶抑制劑，是目前治療痛風(fēng)的首選藥。本實(shí)驗(yàn)在體外直接測定了中藥材提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用，篩選出對黃嘌呤氧化酶具有較好抑制作用的中藥材，以期為相關(guān)中藥材的應(yīng)用及藥效物質(zhì)的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

黃嘌呤氧化酶(Sigma)，別嘌呤醇(Ruibio)，黃嘌呤氧化酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，吳茱萸、大血藤(四平市百草堂中藥飲片有限公司)，老鸛草(湖北金貴中藥飲片有限公司)，木瓜(成都市益誠藥業(yè)有限公司)，鎖陽(四川弘升藥業(yè)有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器)，冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技)，酶標(biāo)儀(Thermo)。

1.2 中藥材提取物的制備

水提取物的制備稱取中藥材100.0 g粉碎成粗粉，料液比1∶10，二次蒸餾水80℃回流提取，連續(xù)提取三次，時(shí)間分別為3 h，2 h，1 h，過濾，合并濾液，濃縮，冷凍減壓干燥，即得水溶性組分，密封干燥保存。

乙醇提取物的制備 稱取中藥材100.0 g粉碎成粗粉，料液比1∶10，75%的乙醇30℃回流提取，連續(xù)提取三次，時(shí)間分別為3 h，2 h，1 h，過濾，合并濾液，濃縮，冷凍減壓干燥，得醇溶性組分，密封干燥保存。

1.3 黃嘌呤氧化酶活性的測定

黃嘌呤氧化酶溶液的配制 在無菌超凈臺(tái)中，冰盒上操作，將5 U(500μL)黃嘌呤氧化酶用7264 μL KH2PO4(50mmol/L)緩沖液溶解，混勻，即得6.44×104U/μL，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

黃嘌呤氧化酶活性(全酶活性)采用紫外分光光度法進(jìn)行測定，使用黃嘌呤氧化酶試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組、實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入25 μLPBS及25μL黃嘌呤氧化酶溶液，空白組以等體積PBS代替黃嘌呤氧化酶，直接加入50μLPBS，按照試劑盒操作依次加入試劑一至試劑四，混勻，37℃避光反應(yīng)20 min，加入1 mL終止反應(yīng)液，混勻，530 nm處測定吸光度(OD值)，平行操作三次，以平均值作為最后結(jié)果。

1.4 別嘌呤醇及中藥材提取物對黃嘌呤氧化酶抑制作用的測定

精密稱取4.0 mg別嘌呤醇溶于1 mL DMSO中，充分混勻，磷酸鹽緩沖液(PBS)梯度稀釋為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025mg/mL，備用。

精密稱取10.0 mg中藥材水提取物溶于0.5 mL PBS中，充分混勻，PBS梯度稀釋成不同濃度，備用。精密稱取10.0mg中藥材乙醇提取物溶于，0.5mL DMSO中，充分混勻，PBS梯度稀釋成不同濃度，備用。

別嘌呤醇及中藥材提取物對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用采用黃嘌呤氧化酶試劑盒進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組、實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入25μL樣品溶液及25μL黃嘌呤氧化酶溶液，空白組以等體積PBS代替黃嘌呤氧化酶，加入25μL樣品溶液及25 μLPBS，按照試劑盒操作依次加入試劑一至試劑四，混勻，37℃避光反應(yīng)20 min，加入1 mL終止反應(yīng)液，混勻，530 nm處測定吸光度(OD值)，平行操作三次，以平均值作為最后結(jié)果。

全酶活性為實(shí)驗(yàn)組的OD值與空白組的OD值之差，即A實(shí)驗(yàn)組－A空白組。別嘌呤醇能夠抑制黃嘌呤氧化酶的活性，在實(shí)驗(yàn)組中加入別嘌呤醇，測定不同濃度的別嘌呤醇作用黃嘌呤氧化酶后生成的紫色產(chǎn)物的OD值，減去空白組OD值作為最后結(jié)果，即B實(shí)驗(yàn)組－B空白組。抑制率(%)的計(jì)算見公式。采用SPSS19.0計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃嘌呤氧化酶活性及別嘌呤醇的抑制作用

黃嘌呤氧化酶在催化次黃嘌呤生成黃嘌呤的過程中會(huì)產(chǎn)生超氧自由基，超氧自由基與電子受體作用，在顯色劑存在時(shí)形成紫色化合物，通過測定紫色化合物吸光度的大小可間接反應(yīng)黃嘌呤氧化酶的活性。紫色化合物吸光度越大，酶活性越強(qiáng)。不同濃度的別嘌呤醇對黃嘌呤氧化酶抑制作用結(jié)果見表1，其半數(shù)抑制濃度IC50為0.112mg/mL。

表1 別嘌呤醇對黃嘌呤氧化酶的抑制作用結(jié)果Tab.1 Xanthine oxidase inhibitory activity of allopurinol

2.2 中藥材提取物對黃嘌呤氧化酶抑制作用

中藥材提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用亦是通過測定加入中藥材提取物后，反應(yīng)體系生成的紫色產(chǎn)物的OD值，減去空白組OD值作為最后結(jié)果，即B實(shí)驗(yàn)組－ B空白組。抑制率(%)按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算，采用SPSS19.0計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50，結(jié)果見表2。5種中藥材的醇提物和水提物(20mg/mL)的抑制率均大于50%，其中老鸛草的水提物及醇提物的抑制率最高，分別為90.95%、94.64%。老鸛草的醇提物及水提物對黃嘌呤氧化酶的半數(shù)抑制濃度 IC50最小，分別為 3.141 mg/mL、2.407 mg/mL。其次，大血藤醇提物與水提物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用也比較明顯，其IC50分別為7.177 mg/mL、9.120mg/mL。

5種中藥材提取物對黃嘌呤氧化酶抑制作用均呈濃度依賴性，提取濃度越大，抑制作用越強(qiáng)。比較5種中藥材的水提物與醇提物對黃嘌呤氧化酶的的半數(shù)抑制濃度IC50，除老鸛草外，其余4種中藥材的醇提物的IC50均小于水提物的IC50。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中陽性對照別嘌呤醇對黃嘌呤氧化酶的半數(shù)抑制濃度IC50為0.112 mg/mL，5種中藥材的提取物對黃嘌呤氧化酶均具有一定的抑制作用，5種中藥材的提取物(20 mg/mL)對黃嘌呤氧化酶的抑制率均大于50%。其中，老鸛草的水提物和醇提物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用最明顯，其IC50分別為2.4070 mg/mL、3.1409 mg/mL。大血藤、鎖陽、吳茱萸、木瓜的乙醇提取物和大血藤的水提取物，對黃嘌呤氧化酶均具較明顯的抑制作用，其IC50值分別為 7.177 mg/mL、7.351 mg/mL、10.203 mg/mL、8.249mg/mL、9.120 mg/mL。對 5 種中藥材醇提物和水提物的抑制作用進(jìn)行比較，除老鸛草外，4種中藥材的醇提物的IC50均小于水提物的IC50，這對進(jìn)一步研究該類中藥材對黃嘌呤氧化酶的抑制作用的藥效物質(zhì)具有一定的參考價(jià)值。

表2 中藥材提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用結(jié)果(n=3) Tab.2 Xanthine oxidase inhibitory activity of extracts obtaubed from Chinese herbalmedicines(n=3)

別嘌呤醇作為首選黃嘌呤氧化酶抑制劑，其作用機(jī)制是由于別嘌呤醇在黃嘌呤氧化酶的作用下生產(chǎn)別黃嘌呤，別黃嘌呤對黃嘌呤氧化酶的親和力大于黃嘌呤及次黃嘌呤，能夠競爭性抑制黃嘌呤氧化酶的作用，進(jìn)而抑制尿酸的產(chǎn)生。此外，黃嘌呤、次黃嘌呤的溶解度高于尿酸，更易隨尿液排出體外，間接降低了血液中的尿酸量。當(dāng)血尿酸濃度低于尿酸的溶解度，可促進(jìn)關(guān)節(jié)處的尿酸結(jié)晶的溶解，以達(dá)到治療痛風(fēng)的作用。但別嘌呤醇在用藥過程存在一系列的毒副作用，如白細(xì)胞及血小板減少、過敏、腹痛，長期使用甚至?xí)T發(fā)中毒性肝炎［1］。因此，尋找安全、能夠有效抑制黃嘌呤氧化酶的中藥材一直是研究的熱點(diǎn)。中藥材中具有大量能夠有效抑制黃嘌呤氧化酶的活性成分，譚明亮等［2］總結(jié)了天然植物中具有黃嘌呤氧化酶抑制作用的中藥提取物，活性部位及單體等物質(zhì)。Cos等［3］綜述了黃酮類化合物作為過氧化物的清除劑對黃嘌呤氧化酶抑制的抑制作用的構(gòu)效關(guān)系，提示中藥材中黃酮類化合物的黃嘌呤氧化酶抑制作用。此外，黃嘌呤氧化酶抑制劑的研究大多通過構(gòu)建高尿酸血癥動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)篩選，實(shí)驗(yàn)周期長，成本高，實(shí)驗(yàn)干擾因素多;在體外進(jìn)行黃嘌呤氧化酶抑制作用的研究，具有高效快速，藥物作用靶點(diǎn)明確等優(yōu)點(diǎn)，是篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的優(yōu)選方法［4］。

本試驗(yàn)中老鸛草、大血藤的提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用均比較明顯。老鸛草富含大量的黃酮類化合物，其主要具有祛風(fēng)濕、止瀉、通經(jīng)絡(luò)等藥理作用［5］;大血藤中含有酚酸、木脂素等化合物，主要具有抑菌、抗過敏、抗氧化、及較好的心血管系統(tǒng)保護(hù)作用［6］，兩者對黃嘌呤氧化酶的抑制作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)僅初步探討了幾種中藥材水提物及醇提物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用，其具體作用機(jī)制及藥效物質(zhì)有待進(jìn)一步深入研究。

［1］楊 媛，李 靜，甄健存，等.抗痛風(fēng)藥別嘌呤醇、苯溴馬隆及秋水仙堿不良反應(yīng)報(bào)告分析［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，15:1296－1297.

［2］譚明亮，陳 剛.天然產(chǎn)物來源的黃嘌呤氧化酶抑制劑研究進(jìn)展［J］.重慶工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，02:86－90.

［3］Cos P，Ying L，Calomme M，etal.Structure activity relationship and classification of fl－ avonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers［J］.Nat Prod，1998，61(1):71－ 76.

［4］張 雪，俸婷婷，黃俊飛，等.降尿酸藥物篩選方法學(xué)研究進(jìn)展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015，06:48－50.

［5］程小偉.老鸛草化學(xué)成分及其生物活性研究［D］.陜西科技大學(xué)，2014.

［6］趙秀梅，柯洪琴，于慧斌.大血藤藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11:41－43.