李瑞龍，陳 杰，王金輝，周彥品，趙長新，*

（1.大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連116034；2.遼寧省發(fā)酵工程重點實驗室，遼寧大連116034）

釀酒酵母細胞表面電位與絮凝相關(guān)性分析

李瑞龍1，陳 杰2，王金輝1，周彥品1，趙長新2，*

（1.大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連116034；2.遼寧省發(fā)酵工程重點實驗室，遼寧大連116034）

為探究釀酒酵母細胞表面所帶電荷與絮凝的相關(guān)性，以兩種液態(tài)發(fā)酵酵母和兩種固態(tài)發(fā)酵酵母為研究對象，并對液態(tài)發(fā)酵酵母FFC2144和固態(tài)發(fā)酵酵母L2Y進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，用zeta電位儀測定其zeta電位，以細胞沉降速率的方法考察酵母的絮凝性。結(jié)果顯示，離子強度為0時，固態(tài)發(fā)酵酵母zeta電位（絕對值）均小于30 mV，液態(tài)發(fā)酵酵母均大于30 mV，培養(yǎng)72 h后的固態(tài)發(fā)酵酵母絮凝率達到了80.2%，液態(tài)發(fā)酵酵母絮凝率最大僅為14.4%。在發(fā)酵過程中不同釀酒酵母電位無明顯變化。隨著傳代次數(shù)的增加釀酒酵母FFC2144 zeta電位無明顯變化，絮凝性能卻逐漸增強，到第20代時絮凝率達到了94.8%。不同釀酒酵母具有不同的zeta電位，其大小客觀地反映出釀酒酵母絮凝性的強弱。釀酒酵母在衰老過程中細胞的絮凝性與zeta電位無關(guān)。

釀酒酵母，zeta電位，絮凝，傳代培養(yǎng)

釀酒酵母在傳代過程中會出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在發(fā)酵能力降低、菌體沉降與衰亡，菌體絮凝增加等方面[1]。釀酒酵母的自絮凝過程是成千上萬個細胞形成的一個不可逆的、無性的且依賴鈣離子的聚集過程[2-3]。釀酒酵母絮凝一直以來都是國際上研究的熱點課題，從生物學的角度來看，引起酵母絮凝的機制紛繁復雜，包括外源性的凝集素、基因調(diào)控、含氧量、溫度和pH等[4-5]。釀酒酵母絮凝的好壞對于發(fā)酵工業(yè)是至關(guān)重要的，例如在啤酒發(fā)酵過程中酵母提前絮凝會導致一系列不良后果，降低生產(chǎn)效率，而在發(fā)酵終點酵母的絮凝性能差將不利于產(chǎn)物的分離純化[6-7]。

酵母細胞在代謝上的變化會通過細胞壁成分的改變體現(xiàn)出來。釀酒酵母懸濁液是一種分散體系，絮凝能否發(fā)生取決于兩方面的因素：一是由酵母細胞壁帶有的凈電荷引起的排斥作用，酵母表面的zeta電位恰好能表征這種電荷的大小，當電位的絕對值大于30 mV時，雙電層厚度較大，釀酒酵母之間發(fā)生彈性碰撞，不利于酵母絮凝，當其小于30 mV時酵母細胞不穩(wěn)定，增加了絮凝的可能性；二是由細胞壁表面的物質(zhì)之間發(fā)生的吸附架橋作用，這種作用在釀酒酵母的絮凝過程中也起到至關(guān)重要的作用[8]。

國外早有利用zeta電位對釀酒酵母進行研究，但大多是與釀酒酵母固定化吸附發(fā)酵相關(guān)的報道[9-10]，應用zeta電位對釀酒酵母絮凝性能進行分析的報道并不多見[11-12]。固態(tài)發(fā)酵酵母與液態(tài)發(fā)酵酵母絮凝性有較大差異，本文試圖通過對不同釀酒酵母以及不同衰老程度酵母的zeta電位和絮凝性能進行研究以期找到zeta電位在釀酒酵母絮凝中起到的作用，為釀酒酵母的絮凝研究提供一種新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）FFC2146、釀酒酵母FFC2144、釀酒酵母L2Y 大連工業(yè)大學菌種保藏所；衡水酵母 河北衡水老白干釀酒（集團）有限公司；葡萄糖 天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純；酵母膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司，化學純；超純水 電阻率為18 mΩ·cm。

低溫冷凍干燥機 美國LABCONCO公司；低速離心機 安徽中佳科學儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS90型Zeta電位測定儀 英國Malvern儀器有限公司；85-2型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；JSM-6460LV型掃描電鏡 日本JEOL公司；JA2003型電子天平 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 釀酒酵母的培養(yǎng) 以斜面保藏的酵母菌種經(jīng)過二次活化，按照5%（v/v）的接種量接種，培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)72 h后轉(zhuǎn)接到新鮮的酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）中，以第一次培養(yǎng)收獲的酵母為第1代酵母菌株，每轉(zhuǎn)接1次增加1代，轉(zhuǎn)接9次后獲得第10代酵母細胞，轉(zhuǎn)接19次后獲得第20代菌株。

1.2.2 釀酒酵母菌懸液的制備 培養(yǎng)72 h后的釀酒酵母發(fā)酵液經(jīng)4000 r/min離心10 min，收集沉淀，再用超純水反復洗滌3次離心收集沉淀，將菌體于-80℃冰箱冷凍12 h，真空冷凍干燥（-48℃，4 Pa）得到干燥的酵母細胞，取一定量的菌體用超純水和不同濃度的NaCl溶液配制成0.2%（w/v）的菌懸液，于磁力攪拌器下攪拌30 s（轉(zhuǎn)速200～222 r/min）后立即進行zeta電位測量。本實驗選取第2、10、20代釀酒酵母為典型研究對象。

1.2.3 釀酒酵母zeta電位測量 將制備好的釀酒酵母菌懸液樣品注入“U”型彎曲式毛細管樣品池中，激光多普勒技術(shù)的應用能夠測定出釀酒酵母細胞在體系中的電泳遷移速率，從而計算出zeta電位的大小。本實驗所有樣品均重復測定五次，測定結(jié)果取平均值。所有測量均在25℃條件下進行，對于同一個樣品zeta電位的測量顯示良好的重復性。

為探究離子強度和pH對液態(tài)發(fā)酵酵母zeta電位的影響，在0～10 mmol/L離子強度梯度，3～10 pH梯度范圍內(nèi)對培養(yǎng)72 h的液態(tài)發(fā)酵酵母FFC2144與FFC2146進行zeta電位測量。在離子強度為0時，于超純水中測量第1代四種不同釀酒酵母的zeta電位。分別于0、1、10 mmol/L離子強度條件下對不同代數(shù)的液態(tài)發(fā)酵釀酒酵母FFC2144和固態(tài)發(fā)酵釀酒酵母L2Y進行zeta電位測量。并測量發(fā)酵過程中不同時期四種釀酒酵母的zeta電位。

1.2.4 釀酒酵母絮凝能力的測定 取1 g干燥釀酒酵母菌體，用超純水稀釋至1×106～3×106個/mL，在磁力攪拌器下攪拌2 min使之充分分散到體系中。每管20 mL分裝后靜置，同時開始計時，每隔3 min從試管中取樣4 mL立即檢測其在波長600 nm處的吸光值，用該值替代釀酒酵母菌體濃度，用以下公式計算絮凝率：

在離子強度為0的條件下，分別測量四種釀酒酵母的絮凝率隨時間的變化曲線。分別于0、1、10 mmol/L離子強度條件下測量不同代數(shù)的FFC2144和L2Y的絮凝率。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件求平均值，進行標準差分析，用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH與離子強度對液態(tài)發(fā)酵酵母細胞zeta電位的影響

圖1 離子強度對FFC2144與FFC2146 zeta電位的影響Fig.1 Effect of ion strength on the zeta potential of FFC2144 and FFC2146

釀酒酵母細胞壁表面附著多種蛋白質(zhì)和糖蛋白[13]。研究表明，它們大致可以分為三類：其中兩類通過共價鍵與細胞壁相偶聯(lián)，另外一類則是缺少與細胞壁相連接的糖苷鍵而附著在細胞壁表面的蛋白質(zhì)[14-15]。蛋白質(zhì)上肽鏈末端帶電的氨基酸殘基決定了酵母細胞帶有靜電荷。靜電荷的多少決定隨著酵母移動的雙電層的厚薄程度，雙電層的厚度越大zeta電位測定結(jié)果越大反之則越小。圖1可以看出釀酒酵母FFC2144和FFC2146 zeta電位絕對值隨著體系中離子強度的增加而減小，當離子強度小于1 mmol/L時，zeta電位變化明顯，離子強度大于1 mmol/L時zeta電位隨離子強度變化并不明顯，這是由于離子強度的增大壓縮了酵母細胞表面的雙電層，引起zeta電位降低，而當離子強度繼續(xù)增大時雙電層的壓縮變得困難zeta電位的變化隨之變得平緩。圖2顯示釀酒酵母FFC2144、FFC2146 zeta電位均為負值，F(xiàn)FC2144酵母zeta電位的絕對值大于FFC2146，隨著pH的增大zeta電位有減小的趨勢，但這種變化并不明顯?？梢钥闯?，釀酒酵母細胞的zeta電位受溶液pH和離子強度大小的影響，pH的變大通過增加溶液中的-OH的濃度改變細胞zeta電位，而離子強度的變化導致的zeta電位變化則是依賴對細胞雙電層的壓縮和釋放來完成的[16]。

圖2 pH對FFC2144與FFC2146 zeta電位的影響Fig.2 Effect of pH on the zeta potential of FFC2144 and FFC2146

2.2 不同釀酒酵母的zeta電位以及絮凝能力差異性比較

圖3 不同種類釀酒酵母zeta電位差異性比較Fig.3 The difference on zeta potential of different varieties of Saccharomyces cerevisiaes

釀酒酵母FFC2144和FFC2146是液態(tài)發(fā)酵菌種，而衡水酵母和釀酒酵母L2Y是固態(tài)發(fā)酵菌種。圖3顯示了不同釀酒酵母在離子強度為0時的zeta電位差異。從圖3中可以看出固態(tài)發(fā)酵酵母的zeta電位明顯高于液態(tài)發(fā)酵酵母，且液態(tài)發(fā)酵菌種zeta電位絕對值均大于30 mV，而固態(tài)發(fā)酵酵母則均低于30 mV。不同液態(tài)發(fā)酵酵母之間，不同固態(tài)發(fā)酵酵母之間zeta電位均表現(xiàn)出了差異性。

圖4是四種菌的絮凝曲線，可以看出固體發(fā)酵酵母的絮凝能力強于液體發(fā)酵酵母，培養(yǎng)72 h的L2Y絮凝率達到了80.2%，而FFC2144絮凝率僅為14.4%，這與他們細胞表面的電位差異是一致的。不同釀酒酵母細胞壁成分的差異性很可能決定了釀酒酵母zeta電位以及絮凝能力的不同。從本實驗看來，不同釀酒酵母都具有固定的zeta電位，酵母細胞表面所帶電荷量越大絮凝性越差。

圖4 不同釀酒酵母絮凝曲線Fig.4 The flocculation curves of different varieties of Saccharomyces cerevisiaes

2.3 不同代數(shù)釀酒酵母FFC2144和L2Y zeta電位以及絮凝能力差異性分析

圖5 不同離子強度下釀酒酵母FFC2144和L2Y zeta電位隨傳代次數(shù)變化曲線Fig.5 The curves of zeta potential of different generation Saccharomyces cerevisiaes FFC2144 and L2Y at different ion strength

以液態(tài)發(fā)酵釀酒酵母FFC2144和固態(tài)發(fā)酵釀酒酵母L2Y為研究對象，圖5顯示了第2～20代酵母在不同離子強度下，兩種酵母zeta電位的變化趨勢，隨著傳代次數(shù)的增加酵母zeta電位處于波動狀態(tài)并未出現(xiàn)明顯的變化。

圖6 不同傳代次數(shù)釀酒酵母FFC2144和L2Y絮凝曲線Fig.6 The flocculation curves of different generation Saccharomyces cerevisiaes FFC2144 and L2Y

從圖6顯示的FFC2144酵母絮凝曲線發(fā)現(xiàn)不同傳代次數(shù)的酵母絮凝率出現(xiàn)了較大的差異，第2代釀酒酵母的絮凝能力最弱，而隨著傳代次數(shù)的增加酵母的絮凝能力逐漸增強，第20代時達到94.8%；而釀酒酵母L2Y絮凝性較強，第2代釀酒酵母絮凝率達到80.2%，隨著傳代次數(shù)的增加酵母的絮凝能力有一定增強，但增強幅度不如FFC2144顯著，這與姚繼斌等[17-18]的實驗結(jié)果是一致的。隨著釀酒酵母FFC2144傳代次數(shù)的增加細胞壁蛋白總體變化不明顯，但會出現(xiàn)明顯的差異性蛋白。結(jié)合酵母絮凝能力的變化，受傳代次數(shù)的影響，細胞分泌了能引起酵母絮凝的蛋白，這些蛋白有可能是Flo基因家族表達的絮凝蛋白Flo1p、Flo5p、Flo9p，也有可能是凝集素蛋白Agalp、Aga2p和Sag1p[19-20]。這些蛋白的表達雖然不足以引起酵母細胞zeta電位發(fā)生明顯的變化，但他們卻通過與鄰近酵母細胞壁上的甘露糖殘基發(fā)生“架橋”作用增加其絮凝能力。這種架橋作用能夠抵消酵母之間由zeta電位引起的靜電排斥力[14]。

2.4 釀酒酵母在發(fā)酵過程中的zeta電位分析

圖7顯示了不同釀酒酵母在發(fā)酵過程中的zeta電位變化趨勢，隨著發(fā)酵時間的增加4種釀酒酵母均未發(fā)生明顯的變化。而W Richard Bowen[16]對3種釀酒酵母的研究表明在發(fā)酵過程中zeta電位均隨發(fā)酵時間的增加而明顯降低，原因在于W Richard Bowen測定zeta電位時釀酒酵母處于發(fā)酵液中，pH隨著發(fā)酵時間的延長而降低，離子強度也時刻發(fā)生著變化?？赡苁怯捎诎l(fā)酵液中離子強度的增大或pH的減小或兩者的共同作用使電位減小。本文測量zeta電位時，將酵母置于標準條件下（超純水制備菌懸液，離子強度為0）。結(jié)合不同代數(shù)釀酒酵母zeta電位分析，盡管細胞在發(fā)酵過程中進行著各種復雜的生命活動，隨著代數(shù)的增加細胞壁表面也出現(xiàn)了差異性蛋白，對于同種酵母zeta電位卻表現(xiàn)出了極強的穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定性再次說明釀酒酵母具有固定的zeta電位，正是由于這種穩(wěn)定性以及菌種之間的差異性，使得利用zeta電位的檢測來進行菌種的鑒別以及絮凝性能的判定成為可能。

圖7 發(fā)酵過程中釀酒酵母zeta電位變化曲線Fig.7 The curves on zeta potentials of Saccharomyces cerevisiaes in the process of fermentation

3 結(jié)論

對不同釀酒酵母的zeta電位測量以及絮凝能力的測定結(jié)果表明，釀酒酵母細胞表面均帶有負電荷，不同釀酒酵母帶有不同數(shù)量的電荷，pH與離子強度能對酵母zeta電位產(chǎn)生影響，離子強度能改變細胞表面的雙電層厚度，對酵母zeta電位有一定影響。固態(tài)發(fā)酵酵母zeta電位明顯大于液態(tài)發(fā)酵酵母的zeta電位，且與各自的絮凝能力表現(xiàn)出一致性：zeta電位絕對值越小菌體絮凝能力越強，zeta電位反映出了酵母絮凝性能的強弱。不同傳代次數(shù)及發(fā)酵過程中zeta電位實驗表明，酵母在傳代培養(yǎng)以及發(fā)酵過程中zeta電位均不發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)出極強的穩(wěn)定性，說明zeta電位對于同一釀酒酵母而言是固定不變的；而不同代數(shù)釀酒酵母絮凝能力卻隨著代數(shù)的增加而增強，在釀酒酵母衰老過程中其絮凝性能與細胞表面電位無關(guān)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是釀酒酵母隨著代數(shù)的增加，細胞壁表面分泌了一些能夠?qū)е滦跄牡鞍祝@些蛋白通過“架橋”作用使酵母聚集[18]。

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Correlation between surface potential and flocculation of Saccharomyces cerevisiae

LI Rui-long1，CHEN Jie2，WANG Jin-hui1，ZHOU Yan-pin1，ZHAO Chang-xin2，*
（1.School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.Key Laboratory of Fermentation Engineering in Liaoning Province，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Two liquid fermentating yeasts and two solid fermentating yeasts were prepared for the research to study the relevance between surface potential and flocculation of Saccharomyces cerevisiae.Saccharomyces cerevisiae FFC144 and L2Y were inoculated from generation to generation，zeta potentials of different breed yeasts and different generation were measured using a standard instrument，yeast flocculability was measured by the method of calculating cells sedimentation rate.Results showed that，when ionic strength was 0，zeta potential of solid fermentating yeasts were less than 30 mV（absolute value），while the liquid fermentating yeasts in all cases were more than 30 mV，the flocculation rate of the solid fermentating yeasts which were cultivated 72 h reached 80.2%，and the liquid fermentating yeasts possessed a maximum value of only 14.4%.There was no significant alteration of the zeta potential in the process of fermentation，and so was the Saccharomyces cerevisiae FFC2144 in the process of subculturing.Flocculability of the Saccharomyces cerevisiae FFC2144 was enhanced gradually which reached 94.8%in the 20th generation.Different Saccharomyces cerevisiae possessed different zeta potential，the magnitude of which objectively reflected the strength of flocculability.In the process of yeast aging，flocculation had nothing to do with the surface potential of cells.

Saccharomyces cerevisiae；zeta potential；flocculation；subculture

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0100-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.012

2015－03－19

李瑞龍（1989-），男，碩士，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：pennylrl@163.com。

*通訊作者：趙長新（1955-），男，大學本科，教授，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：zhaocx@dlpu.edu.cn。