唐 倩 周 楠 唐東山，2 曾鐵兵 朱 洪 張曉文，2

(1.南華大學環(huán)境保護與安全工程學院，湖南 衡陽 421001;2.南華大學放射性三廢處理與處置重點實驗室，湖南 衡陽 421001;3.南華大學醫(yī)學院，湖南 衡陽 421001)

0 引言

多糖(polysaccharides)是除蛋白、核酸外的第三類大分子，是一類生物活性廣泛的極性大分子聚合物，廣泛分布于自然界各類生物體中［1］。胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPSs)是指廣義的細菌胞外多糖，即細胞外含多糖的結(jié)構(gòu)。因細菌和真菌的胞外多糖具有易于分離純化而且產(chǎn)量高等優(yōu)點，人們對來源于微生物的多糖越來越重視，它們在工業(yè)生產(chǎn)中也頗受青睞。藍藻(藍細菌)是地球上最古老的光合放氧原核生物，一直是生物圈的優(yōu)勢生物類群［2］，而荒漠藍藻是荒漠土壤結(jié)皮和荒漠生態(tài)系統(tǒng)中非常重要的優(yōu)勢物種，目前對荒漠藻多糖的研究主要集中在其室內(nèi)培養(yǎng)條件優(yōu)化［3］和抗干旱、抗鹽堿、抗捕食［4－6］及其在沙漠土壤成土中的作用等方面［7］，對荒漠藍藻胞外多糖抗紫外輻射活性的研究還較少。

具鞘微鞘藻(Microcoleus vaginatus Gom.)屬于顫藻科，微鞘藻屬的一種絲狀藍藻，作為荒漠生境中的優(yōu)勢藻種，在長期進化過程中獲得了較強的抗紫外輻射能力，這種能力與其胞外多糖密切相關。許多研究表明:多糖能夠使輻射所引起的遲發(fā)型超敏感性反應低下和SOD活性下降明顯恢復，促進自由基清除，抑制或阻斷自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應［8－9］，因此研究具鞘微鞘藻的胞外多糖抗紫外輻射活性對于進一步了解荒漠藻多糖的生物活性、揭示荒漠藻適應環(huán)境脅迫的機理，進而對于加強荒漠化治理和促進生態(tài)安全具有一定的理論意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

所用試劑純度均為分析純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R－3，瑞士)、高速臺式離心機(TGL－10C，上海)、臺式低溫恒溫振蕩搖床(PSET15OA，上海)、電子天平(AL204，上海)、立式壓力蒸汽滅菌器(BXM－30R，上海)、雙光束紫外可見分光光度計(TU－1901，北京)、水浴恒溫振蕩箱(SHZ－88，江蘇金壇)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP－9080，上海)、核酸蛋白儀(DU640，上海)、磁力加熱攪拌器(78－1，湖南長沙)、人工氣候箱(PYX－250QB，廣東韶關)。

1.2 試驗用胞外多糖

1.2.1 藻種來源與培養(yǎng)

本實驗所用具鞘微鞘藻從中國科學院水生生物研究所藻種庫購得。

藻種恢復培養(yǎng)成功后，采用 BG11培養(yǎng)基(121℃高壓蒸汽滅菌30 min)，通過反復通氣培養(yǎng)來擴大藻種量，培養(yǎng)溫度為25℃，光暗比12∶12，每天手動搖晃數(shù)次。

1.2.2 具鞘微鞘藻粗多糖提取

取培養(yǎng)20 d的微鞘藻，抽濾收集取上清液，抽濾后過0.45μm的微孔濾膜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(40℃，120 r/min)上清液至原來體積的1/4，加入體積倍數(shù)為3倍的95%乙醇，產(chǎn)生白色絮狀沉淀，充分攪拌，4℃靜止沉降過夜后棄上清液，4 000 r/min離心10 min得沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌2～3次。

1.2.3 Sevag 法脫蛋白

將沉淀溶于一定量的水中，加入3倍體積比為3∶1的氯仿和正丁醇混合液，振蕩0.5 h，4 000 r/min離心除去沉淀。重復以上步驟至無白色沉淀生成。多糖含量測定采用酚－硫酸法［10－11］。

1.3 試驗用大腸埃希氏菌

大腸埃希氏菌的菌株為E.coliJM109，取自南華大學醫(yī)學院病原生物學研究所。

在－80℃冰箱中保存的冰凍菌種融化后，接種于預先配置好的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h。根據(jù)試驗要求配制初始濃度約為109CFU/mL的菌懸液:從平板上挑取E.coliJM109接種于4 mL LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)于37℃、220 r/min下振蕩培養(yǎng)4 h后，測定吸光度0.4～0.5麥氏濁度，即為實驗所需菌樣。

1.4 E.coli JM109菌種的紫外輻照存活曲線

(1)取8 mL制備的濃度約為109CFU/mL菌液加到直徑9 cm的小培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)放入無菌磁力攪拌棒，然后置于電磁攪拌器上，15 W和20 W紫外燈下30 cm處，照射前先開啟紫外燈預熱20 min。開啟皿蓋在攪拌狀態(tài)下分別照射 5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 s，每個照射時間設3個平行樣，操作避免白熾光。

(2)取未照射的菌液和照射菌液各1 mL進行稀釋分離，避光置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，利用平板菌落計數(shù)法計數(shù)。

1.5 多糖抗紫外輻射實驗步驟

為得出不同量的多糖對大腸桿菌保護作用的差別，設置200、400、800 mg/L的3個梯度濃度。取濃度為109CFU/mL的大腸埃希氏菌菌懸液1 mL，與濃度為200、400、800 mg/L的多糖溶液7 mL分別混勻，對照為l mL菌懸液與7 mL無菌生理鹽水混勻。將之前已制備好的菌液加到直徑9 cm的小培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)放入無菌磁力攪拌棒，然后置于磁力攪拌器上，于15 W、20 W紫外燈下30 cm處照射，照射前，先開啟紫外燈預熱20 min。開啟皿蓋在攪拌狀態(tài)下分別照射10 s，20 s，40 s及80 s，操作避免白熾光［12］。

取照射后的菌液各1 mL進行稀釋分離，避光置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，利用平板菌落計數(shù)法計數(shù)活菌細胞數(shù)。多糖對實驗菌株的紫外保護作用以抗輻射率(%)表示:

Ai:對照實驗菌液紫外照射后存活的菌數(shù);

Ao:樣品實驗菌液紫外照射后存活的菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌的紫外輻射存活率

圖1為紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率。

圖1 紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率

如圖1所示，輻射時間為5 s時，15W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為50%，20W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為43%;輻射時間為10 s時，15W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為41%，20W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為37%;輻射時間為60 s時，15W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為17%，20W紫外燈輻射下大腸埃希菌存活率為12%;80 s以后，二者的紫外存活率都接近于0。由此可知，隨著輻射時間的增長，大腸埃希菌的紫外存活率越來越低，5～40 s之間，該菌的紫外存活率下降比較明顯，40～60 s之間該菌的紫外存活率的下降速度趨于平緩，但是60 s之后，該菌的紫外存活率又急速下降，80 s以后幾乎沒有存活的菌落。該實驗結(jié)果表明:大腸埃希菌對短時間、低劑量的紫外輻射具有一定的抵抗能力，但對于長時間、高劑量的紫外輻射幾乎沒有抵抗力;在相同功率的紫外燈照射下，紫外存活率隨照射時間延長而降低，高紫外線照射強度對大腸埃希菌的殺菌效果要高于低強度。

紫外線輻射時，大腸埃希氏菌會形成過氧化氫，并進一步產(chǎn)生過氧自由基。由于自由基含未配對的電子，所以極不穩(wěn)定，因此會從鄰近的分子(包括脂肪、蛋白質(zhì)和DNA)上奪取電子，讓自己處于穩(wěn)定的狀態(tài)。這樣一來，鄰近的分子又變成一個新的自由基，然后再去奪取電子，如此連鎖反應的結(jié)果便是讓細胞的結(jié)構(gòu)受到破壞，造成細胞功能喪失、基因突變、甚至死亡。隨著輻射時間的增長，大腸埃希氏菌體內(nèi)產(chǎn)生越來越多的自由基，當自身修復功能不足以阻止自由基的損害時，細胞便走向死亡。

2.2 具鞘微鞘藻胞外多糖抗輻射率

自然界中微生物利用光能、抵御強光的輻射，是光化學反應的主體。紫外線通過光敏化劑間接對DNA產(chǎn)生損傷，通常輻射激發(fā)光敏化劑，產(chǎn)生氧或氫氧自由基，引起脂質(zhì)過氧化，造成對細胞、酶類及核酸等生物大分子的損傷。自由基能造成DNA束斷裂、堿基水合物或者導致DNA和與之相聯(lián)系的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)形成DNA二級結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能影響二聚體形成的位置。

利用抗氧化劑消除紫外線輻射所帶來自由基的侵害是微生物抵抗紫外輻射的一種機理。多糖是一種新興的天然抗氧化劑，多糖能夠使輻射所引起的遲發(fā)型超敏感性反應低下和SOD活性下降明顯恢復，過氧化水平降低。在紫外輻射條件下，多糖對大腸埃希氏菌抗紫外輻射能力有一定的增強效應。

2.2.1 不同功率紫外輻射下，胞外多糖濃度對抗輻射率的影響

如圖2(a)所示，在20 W紫外燈輻射的條件下，添加400 mg/L多糖溶液的大腸埃希氏菌菌懸液的抗輻射率要高于添加200 mg/L與800 mg/L多糖溶液的菌懸液。如當輻射時間為40s時，添加400 mg/L多糖溶液的菌懸液的抗輻射率為41%，添加200 mg/L與800 mg/L多糖溶液的菌懸液的抗輻射率分別為24%和28%;當輻射時間為80 s時，添加400 mg/L多糖溶液的菌懸液的抗輻射率為24%，添加200 mg/L與800 mg/L多糖溶液的菌懸液的抗輻射率分別為16%和20%。在15 W紫外燈輻射的條件下，多糖的抗輻射率與20 W紫外燈輻射下的抗輻射率大體相似，如圖2(b)所示。

圖2 不同紫外燈輻射下多糖抗輻射率

添加400 mg/L多糖溶液且輻射時間為40 s時，大腸埃希氏菌的輻射防護作用最強，這可能是因為濃度為400 mg/L時，多糖能更好地清除由于輻射所導致菌懸液里的細菌組分中分子或原子激發(fā)而產(chǎn)生的自由基，并且能增強大腸埃希氏菌本身的免疫力與抗輻射能力，修復紫外輻射損傷，從而保護菌體。200 mg/L的多糖溶液可能由于量太少，不足以迅速清除因紫外輻射而產(chǎn)生的大量自由基，消除紫外輻射對大腸埃希氏菌的負面影響，并且雖然自由基的存活時間非常短暫只有10 s，但是一旦自由基進入生物體內(nèi)就會直接或間接損傷細胞膜或直接與基因結(jié)合導致細胞轉(zhuǎn)化或死亡。800 mg/L的多糖溶液對大腸埃希氏菌的保護作用低于400 mg/L多糖溶液的原因可能是過量的多糖分子擠占了大腸埃希氏菌的生存空間，阻礙其光復活反應或是DNA修復等活動的進行，因此其對大腸埃希氏菌的保護效果較差。

2.2.2 同紫外輻照時間下，胞外多糖濃度對抗輻射率的影響

同一濃度的多糖大腸埃希氏菌菌懸液的抗紫外輻射率大致隨時間增長呈上升趨勢，但在40 s之后抗輻射率逐漸下降。如圖3所示，在多糖濃度為200 mg/L、紫外燈功率為20W、15W條件下，多糖大腸埃希氏菌菌懸液在40 s的抗輻射率分別為24%和22%，在20 s的抗輻射率分別為15%和14%，在80 s的抗輻射率分別為16%和15%，而在10 s的抗輻射率分別只有8%和7%。這可能是因為當輻射時間比較短時，輻射作用產(chǎn)生的自由基相對較少，所以多糖對大腸埃希氏菌的輻射防護作用相對要小，此外，紫外輻射時間較短時，由于大腸埃希氏菌本身的自我保護能力及自我修復功能使其死亡率較低，這也會致使多糖抗輻射率的下降。

圖3 胞外多糖濃度對不同紫外輻射的抗輻射情況

20W紫外燈輻射條件下，多糖的抗輻射率高于15W紫外燈輻射下的抗輻射率。在多糖濃度為400 mg/L的條件下，20W紫外燈照射條件下多糖的抗紫外輻射率要比15W紫外燈照射條件下的高出約4～10個百分點。這可能是由于在高強度紫外燈輻射下，產(chǎn)生的自由基更多，自由基形成后，它們可以進攻、浸潤和損傷細菌結(jié)構(gòu)，在細胞膜受損部位產(chǎn)生類脂過氧化物，致使死亡的大腸埃希氏菌更多。一方面，在高強度紫外燈輻射下，大腸埃希氏菌本身死亡率較高;另一方面，由于多糖的抗輻射、抗氧化活性增強了大腸埃希氏菌的免疫能力，使該菌在面對高強度紫外輻射時，抵抗能力較強，存活率提高。此外多糖能夠清除因輻射產(chǎn)生的大量自由基，阻止自由基對大腸埃希氏菌的浸潤、攻擊和損傷，維護其生命活動，提高大腸埃希氏菌的紫外存活率。因此，在高強度的紫外輻射條件下，多糖對大腸埃希氏菌的保護作用就更明顯，相對來說抗輻射率就更高。

3 結(jié)論

多糖作為一種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化和清除自由基的作用，可以綜合改善機體的免疫能力和各方面的生理功能。經(jīng)紫外輻射后的細菌，其細胞DNA會受到損傷，即引起DNA分子形成嘧啶二聚體結(jié)構(gòu)［14］，同時還會產(chǎn)生破壞力很強的活性氧自由基，這些自由基反過來又引起DNA分子斷裂，進而影響DNA復制或?qū)е禄蛲蛔儯?5］。多糖可以清除OH、O2－自由基，減少自由基對細胞的損傷，減緩脂質(zhì)過氧化，增強細胞的免疫力，有助于細胞抵抗紫外輻射所引起的損傷。

大腸埃希氏菌是革蘭氏陰性菌，細胞壁外膜含有脂質(zhì)成分，如脂多糖、磷脂和脂蛋白，更易受到氧自由基的侵襲產(chǎn)生類脂過氧化物，損傷細胞的膜結(jié)構(gòu)，導致大腸埃希氏菌的死亡。胞外多糖對大腸埃希氏菌的保護作用一是通過清除自由基，減少自由基對細菌結(jié)構(gòu)的攻擊、損傷，另外一個途徑就是胞外多糖可以增強大腸埃希氏菌的免疫力和抗氧化功能，對抗紫外輻射損傷。

多糖的抗氧化作用已得到廣泛重視，許多研究都表明了多糖具清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化的作用，它可以保護微生物，提高微生物的紫外存活率。本實驗的結(jié)果也說明了這一點，也對將來需要繼續(xù)研究胞外多糖抗紫外輻射活性研究有一定的參考意義。但是關于胞外多糖抗紫外輻射活性還需要更深入的研究，如多糖作用的靶點、有效部位及其機理等。此外，不同的提取方法對多糖結(jié)構(gòu)也會有一定的影響，可能會造成生物活性的差異，因此多糖的提取工藝也應該考慮進來，這些都值得我們進一步探索、研究。

［1］許春平，劉帥，孫斯文.不同來源多糖在降血糖降血脂方面的研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2014，15:115－118.

［2］唐倩，周楠，唐東山.荒漠藍藻抗逆性及應用研究進展［J］.環(huán)境保護與循環(huán)經(jīng)濟，2014，11:34 －37.

［3］張雅涵.具鞘微鞘藻室內(nèi)培養(yǎng)及產(chǎn)胞外多糖條件的優(yōu)化［D］.蘭州:蘭州理工大學，2014.

［4］Hu CX，Zhang D L，Huang Z B，et al.The vertical microdistribution of cyanobacteria and green algae within desert crusts and the development of the algal crusts［J］.Plant Soil，2003，257:97 －111.

［5］Chen L Z，Li D H，Liu Y D.Salt tolerance ofMicrocoleus vaginatusGom.，a cyanbacterium isolated from desert algal crust，was enhanced by exogenous carbohydrates ［J］.J.Arid Environ.，2003，55b:645 －656.

［6］ Stal L J.Cyanobacterial mats and stromatolites［M］//Whitton and Pons(Eds.).The Ecology of Cyanobac teria:Their Diversity in Time and Space.Dordrecht:K luwer Academic Publishers，2000:62.

［7］陳蘭周，劉永定，宋立榮.微鞘藻胞外多糖在沙漠土壤成土中的作用［J］.水生生物學報，2002，02:155 －159.

［8］ Hong－Bin Wang，Sheng－Jun Wu，Dou Liu.Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc communeand their antioxidant activities［J］.Carbohydrate Polymers，2014，99:553–555.

［9］陳立，董俊興.多糖抗輻射作用研究進展［J］.癌變.畸變.突變，2004，06:380 －382.

［10］張惟杰.糖復合物生化研究技術［M］.杭州:浙江大學出版社，2004.

［11］李戰(zhàn).三種紫球藻培養(yǎng)、胞外多糖提取及RAPD分析［D］.上海:上海師范大學，2004.

［12］梁曉婷.Pantoea agglomerans TCa－7抗紫外輻射損傷作用的研究［D］.大連:中國海洋大學，2006.

［13］王洪媛，江曉路，任虹，等.抗UV－B輻射菌紫外吸收代謝產(chǎn)物分析及其抗紫外輻射活性研究［J］.中國海洋藥物，2006，04:1 －5.

［14］謝作明.荒漠藻類對紫外輻射的響應及其結(jié)皮形成的研究［D］.北京:中國科學院研究生院(水生生物研究所)，2006.