成樂琴，金富標(biāo)

（吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022）

0 前言

人參皂苷是人參的有效活性成分，人參皂苷Rg3 作為次級人參皂苷，對肺癌、胃癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞均具有一定的抑制作用[1]，此外，人參皂苷Rg3還具有抗衰老、降壓、增強身體免疫力等作用[2].目前，人參皂苷Rg3 的制備方法主要有酸水解法[3]、酶和微生物降解法[4]、半合成法[5]等，其中采用無機酸或有機酸試劑水解最為常見.自然界中有很多富含有機酸的天然物，例如具有清肺止咳功效的雪梨[6]主要含有蘋果酸、酒石酸、檸檬酸以及少量乙酸、琥珀酸等.在前期研究檸檬[7-8]和葡萄[9]催化制備人參皂苷Rg3 的基礎(chǔ)上，作者利用來源廣泛、價格低廉、可以食用的雪梨為酸催化劑，以原人參二醇組皂苷為原料，在檸檬汁輔助下制備稀有人參皂苷Rg3，探索安全、綠色環(huán)保的制備人參皂苷Rg3 的方法，也為含有清肺止咳功效的雪梨成分的人參皂苷Rg3 產(chǎn)品應(yīng)用于保健食品提供技術(shù)支持和產(chǎn)品支持.

1 原料與方法

1.1 原料和試劑

雪梨、檸檬由超市購買；人參根總皂苷：吉林撫松第一參廠；甲醇、正丁醇、氯仿、硫酸為分析純；HPLC 檢測中所用的甲醇、乙腈為色譜純；蒸餾水為實驗室去離子水；人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、20（S）-Rg3、20（R）-Rg3 標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼斯特生物科技有限公司.

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：大連依利特分析儀器有限公司；色譜柱Pinnacle ⅡC18：RESTEK U.S 的250 mm×4.6 mm，5 μm；RE-52C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 人參根總皂苷中原人參二醇組皂苷的分離提純

按文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行原人參二醇組皂苷（以下簡稱PPD 皂苷）的分離.

1.3.2 檸檬汁輔助雪梨汁制備人參皂苷Rg3 的方法

取若干2.0 mL 離心管，加入200 μL 質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的PPD 水溶液，加入一定量的不同配比的檸檬汁和雪梨汁的混合液，在一定溫度下反應(yīng)數(shù)小時.反應(yīng)產(chǎn)物加入碳酸鈉水溶液調(diào)節(jié)pH=7，用等體積水飽和正丁醇反復(fù)萃取5 次，合并有機層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干.殘留物中加入2 mL 色譜純甲醇，超聲加速溶解，用0.45 μm 濾膜過濾，并通過HPLC 進(jìn)行人參皂苷的定量分析.人參皂苷Rg3 的收率以其兩種差向異構(gòu)體20（S）-Rg3 和20（R）-Rg3 的收率之和計算，具體計算公式如下：

式中，人參皂苷Rg3 的理論產(chǎn)量是原料PPD 皂苷中人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3 和Rd 等5 種皂苷100%轉(zhuǎn)化生成人參皂苷Rg3 時的兩種差向異構(gòu)體20（S）-Rg3 和20（R）-Rg3 的理論產(chǎn)量之和.

1.3.3 HPLC 分析方法

流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：203 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL；流動相A 為乙腈，B 為純凈水（超聲除氣處理）.梯度洗脫程序：0.00～10.00 min，A:22% ；10.00～20.00 min，A:22% ；20.00～25.00 min，A:27% ；25.00～45.00 min，A:31% ；45.00～60.00 min，A:38% ；60.00～65.00 min，A:52% ；65～75 min，A:52% ；75.00～75.10 min，A:55%；75.10～95.00 min，A:90%；95.00～95.10 min，A:90%；95.10～104.00 min，A:22%.

2 結(jié)果與討論

2.1 原料中PPD 皂苷的分離及含量的測定

以人參根總皂苷為原料（其中原人參二醇組皂苷的含量為61.32%），按照文獻(xiàn)[10]的方法，利用D101C 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附和解析，并結(jié)合溶劑沉淀法分離了PPD 皂苷.PPD 皂苷的HPLC 分析圖見圖1.

圖1 分離提純后PPD 皂苷的HPLC 分析圖Fig.1 HPLC analysis of PPD saponins after separation and purification

對圖1 中在保留時間37.85 min、39.43 min、41.70 min、42.39 min 和46.13 min 出現(xiàn)的PPD 皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3 和Rd 的吸收峰分別進(jìn)行了定量（相應(yīng)對照品的保留時間參見圖2-A），結(jié)果表明5 種皂苷的總含量為92.78%，即純度比分離提純之前提高了51.3%.具體皂苷含量數(shù)據(jù)見表1.

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 檸檬汁與雪梨汁的配比對人參皂苷Rg3 收率的影響

在裝有200 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液的2.0 mL 離心管中，分別加入200 μL雪梨汁和檸檬汁配比為100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40 的混合液，在90 ℃水浴鍋中反應(yīng)4 h.反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC 分析結(jié)果見表2.

表1 PPD皂苷中具體皂苷的定量分析結(jié)果Table 1 Quantitative analysis of specific ginsenoside in PPD saponins

由表2 可知，用100%雪梨汁催化反應(yīng)時，人參皂苷Rg3 的收率較低，但加入少量檸檬汁時，Rg3 的收率顯著提高，但繼續(xù)加大檸檬汁比例，雖然PPD 皂苷中各種皂苷的轉(zhuǎn)化率還在提高，但Rg3 的收率卻反而下降，這是因為當(dāng)檸檬酸比例過大時，溶液酸性過強，導(dǎo)致Rg3 進(jìn)一步水解成Rg5等其他次級人參皂苷.考慮到檸檬汁主要是輔助雪梨汁，且其市場價格較高，因此選擇雪梨汁與檸檬汁的配比為90∶10 進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化.

表2 不同雪梨汁與檸檬汁配時人參皂苷Rg3 的HPLC 定量分析結(jié)果Table 2 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different snow pear juice and lemon juice ratio

2.2.2 PPD 皂苷與水果汁體積比對人參皂苷Rg3收率的影響

在裝有200 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液的2.0 mL 離心管中，按照1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6 體積比分別加入配比為90∶10 的雪梨汁和檸檬汁的混合液160 μL、200 μL、240 μL、280 μL、320 μL，并在90 ℃水浴鍋中反應(yīng)4 h.反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC 分析結(jié)果見表3.

表3 不同PPD 皂苷與水果汁體積比時人參皂苷Rg3 的HPLC 定量分析結(jié)果Table 3 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different PPD saponins and fruit juice volume ratio

由表3 可見，隨著果汁用量的增加，人參皂苷Rg3 的收率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當(dāng)PPD 與果汁體積比為1∶1.4 時，人參皂苷Rg3 的收率達(dá)到68.97%，而進(jìn)一步增加體積比，Rg3 的收率和得率明顯下降，說明PPD 與混合果汁體積比為1∶1.4時，反應(yīng)效果最佳.

2.2.3 反應(yīng)溫度對人參皂苷Rg3 的收率影響

將裝有200 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液與配比為90∶10 的雪梨汁與檸檬汁溶液以1∶1.4 混合均勻，分別在75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃水浴鍋中反應(yīng)4 h.反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果見表4.

表4 不同反應(yīng)溫度下人參皂苷Rg3 的HPLC 定量分析結(jié)果Table 4 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different reaction temperature

由表4 可見，隨著反應(yīng)溫度從75 ℃到90 ℃不斷升高，PPD 皂苷的轉(zhuǎn)化率和人參皂苷Rg3 的收率均在逐漸提高，當(dāng)反應(yīng)溫度進(jìn)一步升高時，雖然PPD 皂苷的轉(zhuǎn)化率仍在增加，但人參皂苷Rg3 的收率卻沒有增加，說明較高的反應(yīng)溫度會導(dǎo)致其他副反應(yīng)的發(fā)生.由此可見，制備人參皂苷Rg3 的適宜反應(yīng)溫度為90 ℃.

2.2.4 反應(yīng)時間對制備人參皂苷Rg3 收率的影響

將裝有200 μL 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的PPD皂苷水溶液與配比為90∶10 雪梨汁與檸檬汁溶液以1∶1.4 混合均勻，在90 ℃水浴鍋中分別反應(yīng)3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h、5.0 h.反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC 分析結(jié)果見表5.

表5 不同反應(yīng)時間人參皂苷Rg3 的HPLC 定量分析結(jié)果Table 5 The result of HPLC quantitative analysis for the preparation of ginsenoside Rg3 with different reaction time

由表5 可見，在3.0～4.5 h 范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，除了Rb3 的轉(zhuǎn)化率有所波動以外，其他PPD 皂苷的轉(zhuǎn)化率及Rg3 的收率均顯著增加，當(dāng)反應(yīng)時間為4.5 h 時，人參皂苷Rg3 的收率達(dá)到最高為76.00%（見圖2），而繼續(xù)延長反應(yīng)時間，Rg3 的收率反而下降.這是因為隨著反應(yīng)時間的延長，PPD 皂苷原料逐漸枯竭，使PPD 皂苷轉(zhuǎn)化生成Rg3 的速率低于生成的Rg3 進(jìn)一步通過脫水生成Rg5、Rk1、Rz1 及通過水解生成其他副產(chǎn)品的速率.

圖2 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品(A)及反應(yīng)時間為4.5 h 時PPD 皂苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(B)的HPLC 分析譜圖Fig.2 HPLC analysis of ginsenoside standards(A) and transformation product(B) for PPD saponins in 4.5 h reaction time

3 結(jié)論

通過單因素試驗優(yōu)化了檸檬汁輔助雪梨汁催化水解PPD 皂苷制備稀有人參皂苷Rg3 的工藝條件.結(jié)果表明，人參皂苷Rg3 的最高收率為76.00%，與單獨使用檸檬汁的收率相當(dāng)[8]，說明混合果汁具有很強的酸催化效果及制備人參皂苷Rg3 的能力；同時通過檸檬汁輔助雪梨汁制備人參皂苷Rg3 時，檸檬汁的用量不足單獨使用檸檬汁時其用量的1/6，不僅酸性更加溫和，更容易控制反應(yīng)，而且還能降低成本.

利用富含果酸的雪梨汁與檸檬汁混合液處理PPD 皂苷制備人參皂苷Rg3，與酸性化學(xué)試劑作酸催化劑相比，反應(yīng)過程綠色無污染、操作簡單，反應(yīng)產(chǎn)物兼具人參成分和水果成分，可有效改善產(chǎn)品口感，為大量天然糖苷類化合物的水解制備藥效更好的次級苷提供了新的途徑.

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