李 靜，陳維新，鄧毛程

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300）

0 引言

蛋白酶是重要的水解酶類，主要由動(dòng)物、植物和微生物等生物合成，目前在工業(yè)化運(yùn)用中最為成功、產(chǎn)量最大[1]，并廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、藥品、皮革、紡織和廢物處理等工業(yè)領(lǐng)域.由于水產(chǎn)品蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性，含有豐富的生物活性肽、氨基酸以及高度不飽和脂肪酸等保健成分，近年來(lái)，蛋白酶開(kāi)始出現(xiàn)在水產(chǎn)品加工過(guò)程中，被廣泛應(yīng)用于飼料、食品、化工、醫(yī)藥等各個(gè)領(lǐng)域[2].蛋白酶制劑在整個(gè)酶制劑市場(chǎng)的占有率已超過(guò)65%[3]，且微生物來(lái)源的酶制劑已居主導(dǎo)地位.微生物來(lái)源的蛋白酶除了具備動(dòng)、植物蛋白酶的特性，還具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[4].目前，應(yīng)用于蛋白酶工業(yè)化生產(chǎn)的微生物較多，細(xì)菌主要有地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、短小芽胞桿菌（Bacillus pumilus）、解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等芽胞桿菌屬微生物[4-5]，但國(guó)內(nèi)目前在蛋白酶制劑的研究開(kāi)發(fā)方面與國(guó)外相比，仍有較大差距，因此從特殊來(lái)源、特殊環(huán)境，例如魚(yú)類腸道的低溫環(huán)境中篩選產(chǎn)酶能力強(qiáng)的新型菌種具有重要意義.本試驗(yàn)從廣東省沿海特定水產(chǎn)品海水白鯧的腸道中篩選高產(chǎn)蛋白酶產(chǎn)生菌株，通過(guò)富集培養(yǎng)、平板篩選、搖瓶復(fù)篩等綜合手段獲得一株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌種EF21，采用形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)，以及分子鑒定16S rDNA 分析方法鑒定該菌在進(jìn)化系統(tǒng)中的種屬，并以蛋白酶活力作為判斷指標(biāo)，研究了產(chǎn)酶最優(yōu)氮源、初始pH、溫度、最佳產(chǎn)酶時(shí)間等，擬通過(guò)優(yōu)化各發(fā)酵參數(shù)來(lái)提高產(chǎn)酶能力，以期獲得較好的蛋白酶產(chǎn)生菌株，為將來(lái)進(jìn)一步開(kāi)展酶學(xué)特性研究、工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

海水白鯧魚(yú)：來(lái)自瓊州海峽；酪氨酸：分析純，Sigma 公司；酪蛋白及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

富集培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.0.

平板篩選培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，酪蛋白10 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0.

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.0.

基礎(chǔ)發(fā)酵基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.0.

1.2 儀器與設(shè)備

FA2204 型電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；JA5003 型精密電子天平：杭州中拓儀器有限公司；YX-280D 型蒸汽滅菌器：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-100-Z 型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；A200 型基因擴(kuò)增儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；RDYSP1Z 型核酸電泳儀：北京榮陽(yáng)經(jīng)典科技有限公司；GI-1 型凝膠成像系統(tǒng)：通寶達(dá)成科技（北京）有限公司；S-3000N 型掃描電鏡、H-7650 型透射電鏡：日本日立公司.

1.3 平板篩選

剖開(kāi)鮮活的白鯧魚(yú)，取出腸道，經(jīng)高速勻漿機(jī)搗碎，稱取10 g 搗碎組織，接入100 mL 的富集培養(yǎng)基，置于24 ℃、200 r/min 的條件下培養(yǎng)20 h.將富集培養(yǎng)基稀釋成系列濃度，分別涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，在24 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察各菌落周圍是否有透明圈，挑取具有較大透明圈的單菌落，接入斜面培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)，備用.

1.4 搖瓶篩選

以1.3 中篩選所得的各菌株為篩選對(duì)象，將它們接入種子培養(yǎng)基，在24 ℃、200 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)16 h，以10% 的接種量，將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于同樣條件下進(jìn)行發(fā)酵，在36～72 h 時(shí)間內(nèi)定期測(cè)定發(fā)酵液的蛋白酶活力，比較各菌株的最高值，篩選出高產(chǎn)菌株.

1.5 高產(chǎn)菌種的鑒定

對(duì)優(yōu)選菌株，采用普通光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和透射電鏡觀察菌體形態(tài).采用16S rDNA 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，首先提取高產(chǎn)菌株的16S rDNA，經(jīng)PCR 擴(kuò)增、純化，送至測(cè)序公司進(jìn)行序列檢測(cè)，然后在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）中檢索同源性，以Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[6].參照《Bergy’s Manual of Determinative for Bacteriology》中的試驗(yàn)方法[7]，對(duì)菌種進(jìn)行生理生化特征分析.

1.6 菌種產(chǎn)蛋白酶的氮源

改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，分別以酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸銨為唯一氮源，通過(guò)搖瓶發(fā)酵和測(cè)定發(fā)酵液中的蛋白酶活力，優(yōu)選最佳的氮源.

1.7 菌種產(chǎn)酶的初始pH 和溫度

將培養(yǎng)基的初始pH 分別調(diào)節(jié)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5，接種后，于24 ℃、200 r/min 的條件下進(jìn)行發(fā)酵.另外，將接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基（pH 7.0）在不同溫度、200 r/min 的條件下進(jìn)行發(fā)酵.在發(fā)酵過(guò)程中，定期測(cè)定發(fā)酵液中的蛋白酶活力，以最高值為依據(jù)，優(yōu)選產(chǎn)酶的最佳初始pH 和溫度.

1.8 菌種產(chǎn)蛋白酶的時(shí)間

在最佳的溫度和初始pH 下，以最優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每隔8 h 測(cè)定發(fā)酵液中的蛋白酶活力，根據(jù)蛋白酶活力變化情況，確定最佳的產(chǎn)酶時(shí)間.

1.9 蛋白酶活力的測(cè)定

采用Folin 試劑法測(cè)定發(fā)酵液中的蛋白酶活力[8].

樣品測(cè)定前，配制一系列濃度的酪氨酸溶液，分別吸取1 mL 酪氨酸溶液，與5 mL 的0.4 mol/L碳酸鈉溶液、1 mL 的Folin 試劑混合，于40 ℃水浴中顯色20 min，于660 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度.以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程.

樣品測(cè)定時(shí)，先將酪蛋白溶于pH 7.0 的緩沖液，配制成20 g/L 的酪蛋白溶液，并置于40 ℃水浴中預(yù)熱；然后，將發(fā)酵液的pH 調(diào)節(jié)至7.0，于6 000 r/min、4 ℃下離心20 min，去除菌體，適當(dāng)稀釋上清液，吸取1 mL 稀釋液，經(jīng)40 ℃水浴預(yù)熱5 min，加入1 mL 酪蛋白溶液，置于40 ℃水浴中反應(yīng)20 min；最后，加入2 mL 的0.4 mol/L 的三氯乙酸終止反應(yīng)，經(jīng)10 000 r/min 離心20 min，吸取1 mL 上清液，與5 mL 的0.4 mol/L 碳酸鈉溶液、1 mL 的Folin 試劑混合，于40 ℃水浴中顯色20 min.同時(shí)，需制備一個(gè)對(duì)照體系，即先將待測(cè)的蛋白酶液與三氯乙酸混合，于40 ℃水浴中作用20 min，使蛋白酶失活，再加入酪氨酸溶液，其余步驟同上.以對(duì)照體系為空白，在660 nm 的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度.根據(jù)吸光度測(cè)定值和酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵液中的蛋白酶活力.

酶活力單位定義：在40 ℃和pH 7.0 的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸的酶量，以U表示.

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選

富集培養(yǎng)液經(jīng)酪蛋白平板分離，挑取了62 株在菌落周圍具有明顯透明圈的菌株.這些菌株再經(jīng)搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，表現(xiàn)出不同的產(chǎn)酶能力，圖1 是產(chǎn)酶能力較高的8 株菌.從圖1 看出，菌種EF21發(fā)酵液的蛋白酶活力最高，故將其作為進(jìn)一步研究的對(duì)象.

圖1 菌種篩選結(jié)果Fig.1 Screen result of 8 strains

2.2 高產(chǎn)菌種的鑒定

菌種EF21 的菌體經(jīng)革蘭氏染色，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，呈陽(yáng)性.在掃描電鏡（×8.0 k）、透射電鏡（×2.5 k）下觀察，如圖2 所示，菌體呈桿狀，周生鞭毛，大小為（2.1～4.2）μm ×（0.9～1.0）μm.菌種EF21 的16S rDNA 經(jīng)擴(kuò)增、測(cè)序，可獲得1 227 bp 的序列，在NCBI 中檢索該序列的同源性，發(fā)現(xiàn)其與許多蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）的同源性達(dá)96%～97%.采用Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌種EF21 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3 所示，菌種EF21 與Bacillus cereus Bc（登錄號(hào):KC814644.1）的親緣關(guān)系最近，因而可鑒定菌種EF21 為蠟樣芽胞桿菌.菌種EF21 的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，在表1 中還列舉了早期文獻(xiàn)報(bào)道的兩株蠟樣芽胞桿菌的生理生化特征[9-10]，通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)它們大部分特征相似，但菌種EF21 能夠在較低溫度下生長(zhǎng)，估計(jì)與其來(lái)源于海洋環(huán)境有關(guān).菌種EF21 與數(shù)據(jù)庫(kù)中菌種的最大同源性僅為97%，且生長(zhǎng)溫度較低，可能是新發(fā)現(xiàn)的微生物菌種.

圖2 菌體在掃描電鏡和透射電鏡下的照片F(xiàn)ig.2 SEM and TEM photographs of strain EF21

圖3 菌種EF21 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 The sequence phylogenetic analysis of strain EF21

2.3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基分別采用不同的氮源，發(fā)酵結(jié)果如圖4所示.從圖4 可以看出，相對(duì)于無(wú)機(jī)氮源而言，有機(jī)氮源有利于菌種EF21 產(chǎn)蛋白酶，這與有機(jī)氮源含有誘導(dǎo)作用的肽鏈有關(guān).其中，以蛋白胨為氮源，菌種EF21 的產(chǎn)酶效果最好，雖然菌種EF21 是新型菌種，但試驗(yàn)結(jié)果與早期文獻(xiàn)[11]的其他菌種具有相同之處.

表1 菌種EF21 和兩株蠟樣芽胞桿菌的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain EF21 and two other Bacillus cereus

圖4 不同氮源對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the yield of protease

2.4 初始pH 和溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

初始pH 和溫度對(duì)菌種EF21 產(chǎn)蛋白酶的影響如圖5 所示.初始pH 過(guò)高或過(guò)低均不利于菌種EF21 產(chǎn)蛋白酶，適宜的初始pH 范圍為7.0～7.5，在pH 7.5 時(shí)的產(chǎn)酶量最大.溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響較為明顯，16～24 ℃有利于菌種EF21 產(chǎn)蛋白酶，其中最佳的產(chǎn)蛋白酶溫度為20 ℃.偏堿性、較低溫度的產(chǎn)酶條件與海洋環(huán)境特征一致，表明菌種產(chǎn)酶特性與菌種來(lái)源密切相關(guān).國(guó)內(nèi)關(guān)于產(chǎn)蛋白酶的低溫菌種的報(bào)道不多，肖峰等[12]從黃海海域篩選得到一株產(chǎn)中性蛋白酶菌種Aranicola proteolyticus XF1，最適產(chǎn)酶溫度為25 ℃；王金富等[13]從南極海水中獲得3 株假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）的菌種和1 株科爾韋爾氏屬（Colwellia）的菌種，產(chǎn)蛋白酶的最適溫度為10 ℃左右.菌種EF21 產(chǎn)蛋白酶的溫度較低，在低溫環(huán)境中具有應(yīng)用潛力.

圖5 初始pH 和溫度對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.5 Effect of fermentation conditions on the yield of protease

2.5 最佳產(chǎn)酶時(shí)間的確定

在產(chǎn)蛋白酶的最佳條件下，菌種EF21 的產(chǎn)酶時(shí)間曲線如圖6 所示.在發(fā)酵32 h 以內(nèi)，產(chǎn)酶量較低；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液中蛋白酶活力逐漸增加，64 h 時(shí)達(dá)到最高；在發(fā)酵64 h 以后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)竭盡和發(fā)酵液pH 下降，蛋白酶活力呈下降趨勢(shì).本試驗(yàn)條件下的最佳產(chǎn)酶時(shí)間為64 h，此時(shí)發(fā)酵液中蛋白酶活力達(dá)1 292 U/mL.在蛋白酶活性單位定義的相同情況下，發(fā)酵液中蛋白酶活力的較高水平一般為600～800 U/mL[5，14]；蔡婉玲等[1]報(bào)道了1 株產(chǎn)蛋白酶菌的突變株，其發(fā)酵液的蛋白酶活力達(dá)1 845 U/mL.相對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)，菌種EF21 具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力.

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the yield of protease

3 結(jié)論

從海水白鯧魚(yú)腸道中篩選得到一株蛋白酶高產(chǎn)菌種EF21，經(jīng)鑒定，該菌種被確定為新發(fā)現(xiàn)的蠟樣芽胞桿菌.菌種EF21 產(chǎn)蛋白酶的最佳氮源為蛋白胨，最佳的初始pH、溫度和時(shí)間分別為pH 7.5、20 ℃和64 h.在最佳的產(chǎn)酶條件下，發(fā)酵液中蛋白酶活力達(dá)1 292 U/mL.菌種EF21 適宜在較低溫度下產(chǎn)酶，在低溫環(huán)境中具有巨大的應(yīng)用潛力.由于該菌種是新發(fā)現(xiàn)的海洋微生物，其毒性試驗(yàn)、所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)以及發(fā)酵條件優(yōu)化等工作仍有待繼續(xù)開(kāi)展，進(jìn)一步促進(jìn)工業(yè)化應(yīng)用.

［1］蔡婉玲，田寶玉，郭菁，等.蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選和紫外誘變育種［J］.生物技術(shù)，2011，21（1）:73-76.

［2］Vijayaraghavan P，Lazarus S，Vincent S G P.De-hairing protease production by an isolated Bacillus cereus strain AT under solid -state fermentation using cow dung:Biosynthesis and properties［J］.Saudi Journal of Biological Sciences，2014，21:27-34.

［3］Annamalai N，Rajeswari M V，Sahu S K，et al.Purification and characterization of solvent stable，alkaline protease from Bacillus firmus CAS 7 by microbial conversion of marine wastesand molecular mechanism underlying solvent stability［J］.Process Biochemistry，2014，49:1012-1049.

［4］鄧菊云.微生物堿性蛋白酶研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24（3）:293-296.

［5］黃繼翔.產(chǎn)堿性蛋白酶芽孢桿菌的鑒定［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（2）:157-163.

［6］鄧毛程，王瑤，李靜，等.細(xì)菌纖維素產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其產(chǎn)物分析［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，35（5）:88-92.

［7］Holt S G，Kriey N R，Sneath P H A，et al.Bergy's Manual of determinative for bacteriology［M］.New York：Williams and Wilkins，1998.

［8］Matta H，Punj V.Isolation and partial characterization of a thermostable extracellular protease of Bacillus polymyxa B -17［J］.International Journal of Food Microbiology，1998，42:139-145.

［9］Murugavelh S，Mohanty K.Isolation，identification and characterization of Cr（VI）reducing Bacillus cereus from chromium contaminated soil［J］.Chemical Engineering Journal，2013，230:1-9.

［10］Matsumoto M，De Bont J A M，Isken S.Isolation and characterization of the solvent-tolerant Bacillus cereus strain R1［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2002，94（1）:45-51.

［11］任佩，金玉蘭，樸美子.章魚(yú)腸道產(chǎn)蛋白酶菌的篩選、產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2003，34（1）:189-193.

［12］肖峰，王斌，閆志勇，等.一株產(chǎn)中性蛋白酶海洋細(xì)菌的篩選與初步鑒定［J］.食品與藥品，2011，13（3）:89-94.

［13］王全富，繆錦來(lái)，李光友，等.南極微生物產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的篩選、分子鑒定及部分酶活特性［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2005，12（4）:437-445.

［14］Ibrahim A S S，Al-Salamah A A，Elbadawi Y B，et al.Production of extracellular alkaline protease by new halotolerant alkaliphilic Bacillus sp.NPST-AK15 isolated from hyper saline soda lakes [J].Electronic Journal of Biotechnology，2015，18:236-243.