王 健，艾濤波，岳清洪

（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院（東區(qū)），四川成都，610100）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）具有致癌作用，如今被廣泛用于工業(yè)涂料及動物麻醉[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，氨基甲酸乙酯也是發(fā)酵食品（如醬油、酵母、奶酪）和酒精飲料（如黃酒、白酒、葡萄酒）的副產(chǎn)物[3-6]。而白酒作為一種深受我國大眾喜愛的酒精飲料，市場規(guī)模龐大，有報(bào)道稱[7-8]，中國白酒到2016年將占到全球烈酒消費(fèi)量的近50%，因而針對氨基甲酸乙酯殘留量的測定對于我國食品安全和公眾健康都有著極為重要的意義。

目前關(guān)于食品氨基甲酸乙酯的檢測，我國僅有進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測方法氣相色譜-質(zhì)譜法》[9]以及吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DBS 22/011—2013《飲料酒中氨基甲酸乙酯的測定氣相色譜-質(zhì)譜法》[10]，而氨基甲酸乙酯的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)尚處于征求意見階段。SN/T 0285—2012先采用二氯甲烷液液萃取，然后用正己烷和PSA凈化后進(jìn)行分析，該方法操作費(fèi)時(shí)繁瑣，且回收率不穩(wěn)定。DBS 22/011—2013和食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)（非正式文本）均采用固相萃取技術(shù)，方法簡便易操作，但洗脫時(shí)采用的乙醚屬于易制毒試劑，購買比較麻煩[11-12]。本實(shí)驗(yàn)采用氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱對酒中的氨基甲酸乙酯進(jìn)行提取凈化，同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量[13]，樣品處理步驟簡單迅速，無需其他除雜過程（如正己烷淋洗小柱），且二氯甲烷用量較少，不使用乙醚，采用同位素內(nèi)標(biāo)法也可以避免前處理造成的誤差，方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，在國家標(biāo)準(zhǔn)之外，可供各檢測機(jī)構(gòu)參考用于白酒氨基甲酸乙酯檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純）、二氯甲烷（色譜純）：美國Sigma公司；無水硫酸鈉（分析純）；D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.6%）：加拿大CDN ISOTOPES公司；氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.7%）：美國AccuStandard公司；氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱（Cleanert EC-SPE購于Agela，4 g/25 mL）。白酒：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N/5973i氣相色譜質(zhì)譜儀：美國安捷倫公司；FA2004N分析天平（感量0.000 1 g）：上海菁華公司；Laborota 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國heidolph海道夫公司；DragonLab MX-S漩渦混合器：深圳良誼公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)（D5-氨基甲酸乙酯）溶液的配制：準(zhǔn)確稱取約10 mg（精確至0.000 1 g）D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。取上述儲備液1 mL用乙腈定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)使用液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取約10 mg（精確至0.000 1 g）氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再取上述儲備液1 mL用乙腈定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。用乙腈逐級稀釋使用液，并加入內(nèi)標(biāo)，得到質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL（其中內(nèi)標(biāo)D5-氨基甲酸乙酯質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜操作條件

氣相色譜（gas-chromatography，GC）條件：毛細(xì)柱HP-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度230 ℃；載氣：高純氦氣；流速1 mL/min；程序升溫：60 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min速率升至150 ℃，保持1 min；使用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。

質(zhì)譜（mass spectrometry，MS)條件：接口溫度為240 ℃；電離方式為電子電離源（electron ionization，EI）；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四級桿溫度為150 ℃；掃描模式為單離子檢測掃描（single ion monitoring，SIM）；氨基甲酸乙酯監(jiān)測離子：62，74，89，其中定量離子為62；D5-氨基甲酸乙酯監(jiān)測離子：64，76，89，其中定量離子為64；溶劑延遲時(shí)間為13.5 min。

1.3.3 樣品處理

稱取4 g 白酒于50 mL 樣品瓶中，加入內(nèi)標(biāo)0.4 mL，渦旋混合均勻，將樣品加入氨基甲酸乙酯專用凈化柱上，靜置10 min以保證樣品和填料充分濕潤（可用真空泵施加負(fù)壓以利于填料的吸收）。用20 mL二氯甲烷分兩次洗脫，雞心瓶收集洗脫液，將洗脫液在40 ℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2 mL乙腈洗滌雞心瓶，隨后加入少量無水硫酸鈉，靜置片刻，用有機(jī)相濾膜進(jìn)行過濾，取少量入進(jìn)樣瓶，使用上述儀器條件上機(jī)檢測。

1.3.4 樣品定性與定量

質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子全部出現(xiàn)，同時(shí)所選擇的離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)離子的相對豐度一致，且波動范圍在容許偏差之內(nèi)，可判定樣品中存在氨基甲酸乙酯。用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中氨基甲酸乙酯的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在上述色譜柱和色譜條件下，氨基甲酸乙酯與內(nèi)標(biāo)分離效果好，峰形對稱，靈敏度高。氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的總離子流圖如圖1所示。氨基甲酸乙酯的保留時(shí)間為14.12 min，D5-氨基甲酸乙酯的保留時(shí)間為14.03 min，兩者的保留時(shí)間較接近，定量離子無干擾。分別提取氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的定量離子62和64，其定量離子色譜圖見圖2。氨基甲酸乙酯的質(zhì)譜圖見圖3，D5-氨基甲酸乙酯的質(zhì)譜圖見圖4。

圖1 氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatorgraphy of ethyl carbamate and D5-ethyl carbamate

圖2 D5-氨基甲酸乙酯(A)和氨基甲酸乙酯(B)的定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatography of D5-ethyl carbamate (A)and ethyl carbamate (B)

圖3 氨基甲酸乙酯質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of ethyl carbamate

圖4 D5-氨基甲酸乙酯質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of D5-ethyl carbamate

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

將配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液在設(shè)置好的儀器條件下進(jìn)行檢測，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程為y=6.003x+5.692E-003（相關(guān)系數(shù)為0.999），其中x為峰面積，y為目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg/g），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度色譜圖的信噪比S/N=3計(jì)算，此方法檢出限為1 μg/kg。

2.3 加標(biāo)回收率及精密度

向酒樣中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個質(zhì)量濃度水平下做6次平行實(shí)驗(yàn)，測定加標(biāo)回收率，平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表1。由表1可知，本方法具有較好的精密度和回收率，可以滿足測定要求，樣品中有少量的氨基甲酸乙酯檢出，故加標(biāo)樣品本底為陽性樣品。白酒樣品色譜圖見圖5，白酒樣品加標(biāo)色譜圖見圖6（加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL）。

表1 白酒加標(biāo)回收率及精密度Table 1 The recovery rate and precision of liquor

圖5 白酒樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of Chinese liquor sample

圖6 白酒樣品加標(biāo)色譜圖Fig.6 Chromatogram of Chinese liquor with standard substance

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用該氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱和同位素內(nèi)標(biāo)法檢定白酒中氨基甲酸乙酯能有較好的穩(wěn)定性和回收率，該方法對二氯甲烷的需求量也不高，在做好檢驗(yàn)員防護(hù)的情況下，也是較為安全的。同時(shí)，該氨基甲酸乙酯專用柱具有一定的除雜能力，對白酒中的氨基甲酸乙酯能有較高的靈敏度，快速、簡便，可應(yīng)用于大批量樣品的前處理。

利用該方法隨機(jī)抽取市面上銷售20種白酒產(chǎn)品，氨基甲酸乙酯檢出率為92.1%，含量約為0.01～0.2 μg/g，和國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[14-16]。

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