鄭祖亮，方連英，趙 輝，杜 剛*

（天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

葡萄酒發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，涉及不同種屬的酵母菌和細(xì)菌。葡萄汁中含有許多不同種屬的酵母，其中僅釀酒屬（Saccharomyces）酵母負(fù)責(zé)乙醇發(fā)酵，并且它的次級(jí)代謝產(chǎn)物（如酯類、醛類、酮類、醇類和萜烯類等）是葡萄酒香氣的主要來源，其發(fā)酵性能嚴(yán)重影響葡萄酒的質(zhì)量[1]。研究表明，低溫（10～15 ℃）發(fā)酵影響釀酒酵母代謝產(chǎn)物組成，促進(jìn)葡萄酒芳香化合物的合成，被廣泛應(yīng)用于葡萄酒釀造業(yè)[2]。然而，低溫發(fā)酵也存在一些危害，如漫長(zhǎng)的發(fā)酵周期、遲緩的發(fā)酵速率，甚至是中止發(fā)酵。對(duì)釀酒酵母進(jìn)行低溫篩選、改造，以提高其低溫耐受性是解決這一工業(yè)難題的關(guān)鍵。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直把釀酒酵母響應(yīng)低溫脅迫的耐受機(jī)制作為研究的重點(diǎn)，以便為選育優(yōu)良釀酒酵母提供理論指導(dǎo)。本文主要介紹了不同釀酒酵母在低溫條件下基因差異性表達(dá)、生理特性變化以及低溫識(shí)別和響應(yīng)機(jī)制的研究進(jìn)展，旨在為更好的研究釀酒酵母低溫耐受機(jī)制提供一定的參考。

1 低溫脅迫對(duì)釀酒酵母的影響

在葡萄酒發(fā)酵過程中，低溫（10～15 ℃）不僅會(huì)減緩釀酒酵母的新陳代謝，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，還會(huì)影響乙醇、甘油和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[3]。GAMERO A等[1-2]分析比較13種商業(yè)釀酒酵母分別在28 ℃和12 ℃發(fā)酵周期和代謝產(chǎn)物的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12 ℃時(shí)它們的發(fā)酵周期均在14～25 d，與28 ℃相比延長(zhǎng)了2～3倍；然而在這兩個(gè)溫度條件下，糖的消耗量基本相同，主要代謝物（乙醇和甘油）的合成量沒有顯著性差異（P＜0.05），但是芳香化合物的合成量卻存在巨大差異，乙酯類更易在12 ℃合成，高級(jí)醇和醋酸酯類卻恰好相反。另外，低溫還影響酵母細(xì)胞RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性、蛋白質(zhì)的翻譯率和折疊速率，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白的積累、酶的失活、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率和細(xì)胞繁殖速率的降低，甚至使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)[4]。盡管低溫對(duì)葡萄酒發(fā)酵造成一定的危害，但是又促進(jìn)了葡萄酒中乙酯、萜烯類物質(zhì)的合成，降低高級(jí)醇和醋酸酯類的含量，增加葡萄酒的香氣。

2 釀酒酵母對(duì)低溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)

從基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方面分析比較不同種屬（嗜溫和嗜冷）釀酒酵母響應(yīng)低溫脅迫的差異性變化，發(fā)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)、翻譯效率和脂質(zhì)的組成存在顯著性差異。這些變化與低溫耐受性密切相關(guān)。

2.1 脂質(zhì)組成與低溫耐受性

生物膜是細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境與外部環(huán)境的第一層屏障。當(dāng)酵母細(xì)胞處于低溫環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膜的物理特性首先受到影響，如降低細(xì)胞膜流動(dòng)性。研究表明，增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸和中鏈脂肪酸脂質(zhì)的含量，可提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，并且這些脂質(zhì)含量的高低與酵母適應(yīng)低溫生長(zhǎng)密切相關(guān)[2-5]。分析釀酒酵母在低溫下脂質(zhì)組成變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12 ℃條件下中鏈脂肪酸、三酰甘油、固醇酯和鯊烯的含量普遍升高，而長(zhǎng)鏈脂肪酸、磷脂酸的含量和卵磷脂/磷脂酰乙醇胺的比例均降低[6]。另外，利用基因工程技術(shù)，將與脂質(zhì)合成相關(guān)基因做敲除或高表達(dá)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，涉及磷脂（PSD1和OPI3）、甾醇（ERG3和IDI1）和鞘磷脂（LCB3）途徑的基因，其缺失嚴(yán)重?fù)p害低溫環(huán)境下酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，而它們的高表達(dá)菌株卻幾乎使生長(zhǎng)周期縮減了一半，提高了發(fā)酵速率[7-8]。

2.2 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和翻譯效率與低溫耐受性

TRONCHONI J等[9]利用基因芯片技術(shù)分別研究嗜溫釀酒酵母（S.cerevisiae）和嗜冷釀酒酵母（S.kudriavzevii）（兩者之間86%的基因序列相似）在28 ℃和12 ℃全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S.cerevisiae的177個(gè)基因被上調(diào)和194個(gè)基因被下調(diào)，而S.kudriavzevii的分別為160個(gè)和128個(gè)，兩者之間無較大差別；然而它們的基因轉(zhuǎn)錄水平卻存在顯著性差異，12 ℃條件下S.kudriavzevii的231個(gè)基因被高表達(dá)，而S.cerevisiae只有78個(gè)；此外，在12 ℃下經(jīng)過巴龍霉素（蛋白質(zhì)翻譯抑制劑）處理后，S.cerevisiae的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，而S.kudriavzevii幾乎不受影響，在28 ℃下的恰好相反。這表明S.kudriavzevii的耐受低溫特性是由于低溫環(huán)境下基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和蛋白質(zhì)的翻譯效率被提高。

3 釀酒酵母對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制

圖1 釀酒酵母低溫信號(hào)通路示意圖[10]Fig.1 Schematic diagrams of the low temperature signal pathways in S.cerevisiae

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與環(huán)境刺激所引起的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)密切相關(guān)。在真核細(xì)胞中最常見的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase cascades，MAPKs）級(jí)聯(lián)，通過連續(xù)的磷酸化傳遞信號(hào)，激活相應(yīng)的細(xì)胞應(yīng)答。在釀酒酵母中有五個(gè)核心MAPKs：Hog1p、Slt2p、Fus3p、Kss1p和Smk1p，分別調(diào)控高滲透性甘油合成（the high osmolarity glycerol pathway，HOG）、細(xì)胞壁完整性（the cell wall integrity pathway，CWI）、細(xì)胞繁殖、菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢途徑[10]。研究表明，低溫耐受性與HOG、CWI、環(huán)磷酸腺苷活化蛋白激酶A（the cAMP-activated protein kinase A pathway，cAMP-PKA）和雷帕霉素信號(hào)級(jí)聯(lián)（the target-ofrapamycin signaling pathway，TOR）途徑密切相關(guān)（見圖1）。

3.1 HOG途徑對(duì)低溫信號(hào)的識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo)

HOG途徑是釀酒酵母維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡以適應(yīng)外界高滲環(huán)境的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，由兩個(gè)上游滲透壓感應(yīng)受器（Sln1-Ypd1-Ssk1和Sho1分支）和下游MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)組成（如圖1）。脅迫信號(hào)由Sln1-Ypd1-Ssk1和/或Sho1分支傳遞到Pbs2p MAPKK，激活Hog1p MAPK?；罨腍og1p MAPK進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控一系列的轉(zhuǎn)錄因子，如Sko1p、Smp1p、Hot1p、Msn2p/Msn4p等，進(jìn)而調(diào)控一系列相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化[11]。

HOG途徑中，基因Sho1突變體對(duì)低溫脅迫不敏感，而基因Ssk1突變體對(duì)低溫脅迫敏感，此外基因Hog1突變體會(huì)損害海藻糖合成酶基因、甘油合成酶基因和小分子伴侶的表達(dá)，進(jìn)而影響酵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)[12]?；騉le1、Tip1和Nsr1由活化的Hog1p MAPK獨(dú)立誘導(dǎo)，它們的轉(zhuǎn)錄表達(dá)促進(jìn)了胞內(nèi)甘油的合成和積累，以保護(hù)細(xì)胞免受低溫?fù)p傷[13]。由此可知，HOG途徑是釀酒酵母響應(yīng)低溫脅迫的一種應(yīng)激方式，且低溫信號(hào)由Sln1-Ypd1-Ssk1分支所識(shí)別。

3.2 釀酒酵母CWI途徑對(duì)低溫信號(hào)的識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo)

CWI途徑具有調(diào)控基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞骨架維護(hù)、DNA修復(fù)和細(xì)胞代謝等功能[14]。典型的CWI途徑由細(xì)胞壁完整性和應(yīng)激反應(yīng)元件家族（wall integrity and stress response component，Wsc）、Pkc1p MAPKKKK、Bck1p MAPKKK、Mkk1p/Mkk2p MAPKK和Slt2p MAPK組成（如圖1）。CWI途徑不僅修復(fù)由化合物、氧化和熱休克所造成的細(xì)胞壁損傷[15]，而且響應(yīng)低溫脅迫。

CWI途徑中，Wsc1p是最重要的低溫信號(hào)識(shí)別元件。12 ℃條件下，Wsc1突變體降低Slt2p的磷酸化水平，影響酵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，而在Wsc2/Wsc3雙突變體中此缺陷更加明顯。另外，缺少Rom1p或Rom2p（Pkc的兩個(gè)上游效應(yīng)器）、Bck1p、Mkk1p/Mkk2p或Slt2p都嚴(yán)重影響低溫條件下酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖[16-17]。由此可知，CWI途徑對(duì)響應(yīng)低溫脅迫有著重要作用。然而，讓人不解的是Slt2p的磷酸化完全依賴于Bck1p，而Bck1突變體經(jīng)熱處理后仍然能夠激活Slt2p[18]。低溫信號(hào)是如何從Wsc1p-3p傳遞到MAPK模塊，此過程是否只依賴Bck1p和Pkc1p傳遞信號(hào)，這些理論機(jī)制目前尚不清楚。

3.3 各轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互協(xié)調(diào)以響應(yīng)低溫脅迫

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，真核生物形成了一系列非常保守的生理適應(yīng)機(jī)制。這些機(jī)制不僅獨(dú)立響應(yīng)環(huán)境脅迫，而且大多數(shù)情況下是以相互協(xié)調(diào)的方式對(duì)外界環(huán)境變化做出應(yīng)答。

CWI途徑中，Slt2p的激活可能需要額外脅迫信號(hào)的輸入，并且需要其他效應(yīng)器或MAPK信號(hào)途徑的介導(dǎo)[15]。有趣的是，Hog1p MAPK的磷酸化峰在低溫處理5 min左右出現(xiàn)，而Slt2p MAPK的活化峰出現(xiàn)在120～180 min之間，這說明CWI途徑不能直接感知低溫信號(hào)，而是通過其他MAPK途徑引發(fā)的二次效應(yīng)[19]。另外，HOG途徑中的Sho1分支對(duì)于CWI途徑響應(yīng)酶解酶脅迫是必不可少的[20]，也有證據(jù)表明HOG和CWI途徑并不相互排斥[21]，它們之間相互協(xié)調(diào)，共同響應(yīng)低溫脅迫。遺憾的是，目前并沒有直接證據(jù)表明CWI途徑是由Hog1p信號(hào)激活的。

TOR和cAMP-PKA途徑是酵母細(xì)胞調(diào)控營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的主要元件[22-23]。這兩個(gè)途徑中各元件基因的突變體在低溫下都顯示生長(zhǎng)缺陷。如Torc1（編碼TOR激酶復(fù)合物I）或Ira2（cAMP-PKA途徑的負(fù)調(diào)控因子）突變體對(duì)低溫敏感，而Ras2突變體會(huì)促進(jìn)低溫條件下細(xì)胞的生長(zhǎng)[17，24]。CWI途徑中Slt2p 的激活導(dǎo)致Torc1p 失活，間接抑制Sch9p（TORC1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游靶點(diǎn)）的活化[22]，并直接激活Bcy1p，隨之降低PKA的活性[25]。CWI-TOR-cAMP-PKA途徑之間似乎有著密切的關(guān)聯(lián)，并且Slt2p對(duì)協(xié)調(diào)各途徑以適應(yīng)低溫環(huán)境發(fā)揮著重要作用。

4 展望

Saccharomyces是葡萄酒釀造的主要微生物，提高其低溫耐受性不僅保證低溫發(fā)酵過程中具有良好的繁殖能力和發(fā)酵活性，還可促進(jìn)芳香化合物的合成，提高葡萄酒的品質(zhì)和產(chǎn)量。目前，對(duì)不同種屬釀酒酵母低溫耐受性做了大量研究，發(fā)現(xiàn)了許多與低溫適應(yīng)性相關(guān)的新途徑，例如氧化還原酶和維生素合成途徑，以及氨基酸代謝等[26-27]；以及利用基因工程對(duì)商業(yè)釀酒酵母（QA23，Lallemand Inc）進(jìn)行改造，基因Csf1、Hsp104和Tir2等的過表達(dá)菌株不僅縮短了低溫生長(zhǎng)周期，還提高了發(fā)酵速率。盡管如此，釀酒酵母耐受低溫的理論機(jī)制仍不清楚，基因工程改良菌株也僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，相信越來越多的未知功能基因?qū)?huì)被發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母低溫耐受性的理論機(jī)制也將更加清晰。這將指導(dǎo)獲取低溫耐受性的新型釀酒酵母以及形成新的策略提高葡萄酒發(fā)酵產(chǎn)量和質(zhì)量，以此解決葡萄酒低溫發(fā)酵所面臨的種種困難。

[1]GAMERO A,TRONCHONI J,QUEROL A,et al.Production of aroma compounds by cryotolerantSaccharomycesspecies and hybrids at low and moderate fermentation temperatures[J].J Appl Microbiol,2013,114(5):1405-1414.

[2]GAMERO A,BELLOCH C,IBANEZ C,et al.Molecular analysis of the genes involved in aroma synthesis in the speciesS.cerevisiae,S.kudriavzeviiandS.bayanusvar.uvarumin winemaking conditions[J].PLoS One,2014,9(5):e97626.

[3]BELTRAN G,NOVO M,GUILLAMON J M,et al.Effect of fermentation temperature and culture media on the yeast lipid composition and wine volatile compounds[J].Int J Food Microbiol,2008,121(2):169-177.

[4]AGUILERA J,RANDEZ-GIL F,PRIETO J A.Cold response inSaccharomyces cerevisiae:new functions for old mechanisms[J].FEMS Microbiol Rev,2007,31(3):327-341.

[5]REDON M,GUILLAMON J M,MAS A,et al.Effect of growth temperature on yeast lipid composition and alcoholic fermentation at low temperature[J].Eur Food Res Technol,2011,232(3):517-527.

[6]TRONCHONI J,ROZES N,QUEROL A,et al.Lipid compositi on of wine strainsSaccharomyces kudriavzeviiandSaccharomyces cerevisiaegrown at low temperature[J].Int J Food Microbiol,2012,155(3):191-198.

[7]REDON M,BORRULL A,LOPEZ M,et al.Effect of low temperature upon vitalityofSaccharomyces cerevisiaephospholipid mutants[J].Yeast,2012,29(10):443-452.

[8]LOPEZ-MALO M,CHIVA R,ROZES N,et al.Phenotypic analysis of mutant and overexpressing strains of lipid metabolism genes inSaccharomyces cerevisiae:implication in growth at low temperatures[J].Int J Food Microbiol,2013,162(1):26-36.

[9]TRONCHONI J,MEDINA V,GUILLAMON J M,et al.Transcriptomics of cryophilicSaccharomyces kudriavzeviireveals the key role of gene translationefficiencyin cold stressadaptations[J].BMC Genomics,2014,15(1):432.

[10]CHEN R E,THOMER J.Function and regulation in MAPK signaling pathways:lessons learned from the yeastSaccharomyces cerevisiae[J].Biochimica Biophysica Acta,2007,1773(8):1311-1340.

[11]SAITO H,POSAS F.Response to hyperosmotic stress[J].Genetics,2012,192(2):289-318.

[12]HAYASHI M,MAEDA A.Activation of the HOG Pathway upon cold stress inSaccharomyces cerevisiae[J].J Biochem,2006,139(4):797-803.

[13]PANADERO J,PALLOTTI C,VARGAS SR,et al.A downshift in temperature activates the high osmolarity glycerol (HOG) pathway,which determines freeze tolerance inSaccharomyces cerevisiae[J].J Biol Chem,2006,281(8):4638-4645.

[14]MASCARAQUE V,HERNAEZ M L,JIMENEZ-SANCHEZ M,et al.Phosphoproteomic analysis of protein kinase C signaling inSaccharomyces cerevisiaereveals Slt2 mitogen-activated protein kinase(MAPK)-dependent phosphorylation of eisosome core components[J].Mol Cell Proteomics,2013,12(3):557-574.

[15]FUCHS B B,MYLONAKIS E.Our paths might cross:the role of the fungal cell wall integrity pathway in stress response and cross talk with other stress response pathways[J].Eukaryotic Cell,2009,8(11):1616-1625.

[16]TORRES-QUIROZ F,GARCIA-MARQUES S,CORIA R,et al.The activity of yeast Hog1 MAPK is required during endoplasmic reticulum stress induced by tunicamycin exposure[J].J Biol Chem,2010,285(26):20088-20096.

[17]CORCOLES-SAEZ I,BALLESTER-TOMAS L,DE LA TORRE-RUIZ M A,et al.Low temperature highlights the functional role of the cell wall integrity pathway in the regulation of growth inSaccharomyces cerevisiae[J].Biochem J,2012,446(3):477-488.

[18]HARRISON J C,ZYLA T R,BARDES,et al.Stress-specific activation mechanisms for the“cell integrity”MAPK pathway[J].J Biol Chem,2004,279(4):2616-2622.

[19]MENSONIDES F I,BRUL S,KLIS F M,et al.Activation of the protein kinase C1 pathway upon continuous heat stress inSaccharomyces cerevisiaeis triggered by an intracellular increase in osmolarity due to trehalose accumulation[J].Appl Microbiol Biot,2005,71(8):4531-4538.

[20]GARCIA R,RODRIGUEZ-PENA J M,BERMEJO C,et al.The high osmotic response and cell wall integrity pathways cooperate to regulate transcriptional responses to zymolyase-induced cell wall stress inSaccharomyces cerevisiae[J].J Biol Chem,2009,284(16):10901-10911.

[21]CASAGRANDE V,DEL VESCOVO V,MILITTI C,et al.Cesium chloride sensing and signaling inSaccharomyces cerevisiae:an interplay among the HOG and CWI MAPK pathways and the transcription factor Yaf 9[J].FEMS Yeast Res,2009,9(3):400-410.

[22]HUGHES HALLETT J E,LUO X,CAPALDI A P.State transitions in the TORC1 signaling pathway and information processing inSaccharomyces cerevisiae[J].Genetics,2014,198(2):773-786.

[23]SOLARI C A,TUDISCA V,PUGLIESSI M,et al.Regulation of PKA activity by an autophosphorylation mechanism inSaccharomyces cerevisiae[J].Biochem J,2014,462(3):567-579.

[24]PARK J I,GRANT C M,DAWES I W.The high-affinity cAMP phosphodiesterase ofSaccharomyces cerevisiaeis the major determinant of cAMP levels in stationary phase:involvement of different branches of the Ras-cyclic AMP pathway in stress responses[J].Biochem Bioph Res Co,2005,327(1):311-319.

[25]SOULARD A,CREMONESI A,MOES S,et al.The rapamycin-sensitive phosphoproteome reveals that TOR controls protein kinase A toward some but not all substrates[J].Mol Biol Cell,2010,21(19):3475-3486.

[26]PAGET C M,SCHWARTZ J M,DELNERI D.Environmental systems biology of cold-tolerant phenotype inSaccharomycesspecies adapted to grow at different temperatures[J].Mol Ecol,2014,23(21):5241-5257.

[27]LOPEZ-MALO M,GARCIA-RIOS E,CHIVA R,et al.Effect of deletion and overexpression of tryptophan metabolism genes on growth and fermentation capacity at low temperature in wine yeast[J].Biotechnol Progr,2014,30(4):776-783.

[28]CHIVA R,LOPEZ-MALO M,SALVADO Z,et al.Analysis of low temperature-induced genes(LTIG)in wine yeast during alcoholic fermentation[J].FEMS Yeast Res,2012,12(7):831-843.