劉倫倫，劉 焱*，黎 迅

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

抗菌肽是具有抗菌活性的肽類的總稱，抗菌肽不但具有廣譜的抗菌活性，而且還有抗癌、抗病毒、抗寄生蟲、促進(jìn)傷口愈合等作用[1]。DE LATOUR F A[2]從眼鏡蛇中提取的抗菌肽能抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)；袁永俊等[3]研究表明，酶解得到的酪蛋白抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌有抑菌作用；HWANG B等[4]從柑橘鳳蝶中提取的抗菌肽Papiliocin通過(guò)調(diào)節(jié)活性氧和羥自由基的積累控制白色念珠菌的凋亡；此外，相關(guān)研究表明某些抗菌肽對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用明顯[5-7]。據(jù)BARONI A等[8]的報(bào)道，蛙皮素可能參與傷口的皮膚修復(fù)?？梢?jiàn)，抗菌肽具有較大的藥用開發(fā)價(jià)值。在近幾年中，抗菌肽逐漸成為免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，有望開發(fā)成為新一代肽類抗菌、抗癌等藥物的來(lái)源。對(duì)抗菌物質(zhì)的提取純化是將其進(jìn)行性質(zhì)分析和應(yīng)用的前提，因此開發(fā)利用一種新的抗菌肽，提取純化的步驟至關(guān)重要。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道提取抗菌肽的方法較多，如用乙腈、甲醇、鹽酸、乙酸浸提，其中用乙酸浸提是最常用的方法[9-10]。CHARLET M等[11]用乙酸從貽貝中提取mytilus defensins，mytilins，mytimycin。韓俊文[12]用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液浸提牛蛙的皮膚，得到2種抑菌活性肽；LI C等[13]用含0.1%三氟乙酸的體積分?jǐn)?shù)為60%的乙腈浸提海膽，提取到了有抗菌活性的陽(yáng)離子肽。草魚腸道作為草魚加工的副產(chǎn)物，直接丟棄會(huì)造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，從草魚腸道中提取抗菌活性物質(zhì)，有利于提高草魚腸道的利用價(jià)值。目前草魚腸的相關(guān)研究較少，且主要是基因方面的研究[14-16]。由于超聲能夠促進(jìn)目標(biāo)物的溶解，而低溫有利于保護(hù)抗菌物的活性。因此，本試驗(yàn)采用超聲提取與低溫浸提結(jié)合的方法，從草魚腸道中提取抗菌活性物質(zhì)，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究乙酸體積分?jǐn)?shù)、料液比和超聲時(shí)間對(duì)提取草魚腸道抗菌物質(zhì)的影響，以期得到草魚腸道抗菌物質(zhì)的最佳提取條件，為其進(jìn)一步的分析和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚魚腸：東湖小區(qū)謝師傅烤魚店收集。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室貯藏。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙酸（分析純）、考馬斯亮藍(lán)G250、乙醇（分析純）、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸（色譜純）：天津市光復(fù)精細(xì)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HWS-280型智能培養(yǎng)箱：寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；FD-1B-80型真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康技術(shù)公司；UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、AUY220型分析天平：日本島津公司；S20型pH計(jì)：美國(guó)Mettler Toledo公司；2～20 μL微量移液槍：德國(guó)Eppendorf公司；CF16RXII型立式高速冷凍離心機(jī)：日本Hitachi公司；KQ5200E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將收集的草魚腸剪開，用蒸餾水洗凈，并用攪碎機(jī)攪碎成漿狀。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

在乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%、4%、8%、12%、16%，料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL），超聲時(shí)間分別為0、10 min、20 min、30 min、40 min的條件下，超聲功率為200 W、頻率為40 kHz，4 ℃浸提24 h后，20 000×g離心20 min，收集上清液，考察乙酸體積分?jǐn)?shù)、料液比及超聲時(shí)間對(duì)提取物質(zhì)抗菌活性的影響。

1.3.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，料液比（A）、乙酸體積分?jǐn)?shù)（B）超聲時(shí)間（C）為影響因素，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.4 抑菌活性測(cè)定

菌種活化：用接種環(huán)將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

抑菌活性測(cè)定：抑菌活性采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定。取0.1 mL活化的菌種，均勻涂布到直徑為9 cm的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，并放置直徑為6 mm的濾紙片，取上清液15 μL滴在濾紙片上，并以相同pH值的乙酸稀釋液為對(duì)照組，培養(yǎng)12 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.5 紫外最大吸收峰測(cè)定

將試驗(yàn)離心得到的上清液用蒸餾水稀釋100倍，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行波譜掃描，掃描范圍為190～700 nm，確定提取液的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》中考馬斯亮藍(lán)（Bradford）法[17]。

1.3.7 對(duì)照組的設(shè)定

因?yàn)橐宜釋?duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也有一定的抑菌作用，而在試驗(yàn)過(guò)程中乙酸由于被腸道堿性物質(zhì)中和、被腸道勻漿液稀釋和自身的揮發(fā)等，而產(chǎn)生了部分的減少，所以最終以與抑菌物質(zhì)提取液的pH值相同的乙酸溶液作為對(duì)照組。

1.3.8 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性分析采用Duncan新復(fù)極差法（SSR），且α為0.05，數(shù)據(jù)表示采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)記字母法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙酸體積分?jǐn)?shù)的選擇

圖1 不同乙酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)大腸桿菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)抑菌效果的影響Fig.1 Effect of different acetic acid concentration on antibacterial effect ofEscherichia coli (A) andStaphylococcus aureus (B)

由圖1可知，以大腸桿菌的抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%和4%時(shí)，抑菌圈較小，并且二者之間沒(méi)有顯著區(qū)別；乙酸體積分?jǐn)?shù)分別為4%、8%和12%時(shí)，這三個(gè)水平之間的區(qū)別也不顯著；乙酸體積分?jǐn)?shù)為16%時(shí)，抑菌圈相對(duì)其他4組明顯較高，為2.297 0 cm。而以金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%和4%時(shí)，抑菌圈直徑較小，并且二者之間沒(méi)有顯著區(qū)別；在8%～16%的范圍內(nèi)，抑菌圈直徑隨著乙酸體積分?jǐn)?shù)的增加，最高可達(dá)6.427 0 cm，抑菌效果呈現(xiàn)幅度較大的增加趨勢(shì)，且這三個(gè)水平之間存在顯著差異。

乙酸體積分?jǐn)?shù)為16%時(shí)，提取液的pH值為3.30，此時(shí)，以大腸桿菌的抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)照組的抑菌圈直徑為1.055 0 cm，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果存在明顯干擾，這是因?yàn)橐宜狍w積分?jǐn)?shù)過(guò)大，也產(chǎn)生了部分抑菌效果（以金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為指標(biāo)，對(duì)照組的抑菌圈直徑為0.600 0 cm）；乙酸體積分?jǐn)?shù)為10%～12%時(shí)，對(duì)照組無(wú)明顯的抑菌效果。綜合考慮，8%～12%的乙酸體積分?jǐn)?shù)比較適宜。

2.1.2 料液比的選擇

圖2 不同料液比對(duì)大腸桿菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)抑菌效果的影響Fig.2 Effect of different solid-liquid ratio on antibacterial effect ofEscherichia coli (A) andStaphylococcus aureus (B)

由圖2可知，以大腸桿菌的抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，料液比為1∶3（g∶mL）和1∶5（g∶mL）時(shí)，抑菌圈直徑較大，分別為1.706 0 cm和1.996 0 cm，且二者水平之間存在顯著差異；料液比為1∶1、1∶2、1∶4（g∶mL）時(shí)，這三個(gè)水平之間抑菌圈直徑?jīng)]有顯著區(qū)別，且相對(duì)其他兩組抑菌圈直徑較小。以金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，料液比為1∶5（g∶mL）時(shí)，金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均值最小，為3.260 5 cm；而料液比為1∶2～1∶4（g∶mL）時(shí)，金黃色葡萄球菌的抑菌圈較大，分別為4.859 0 cm、5.118 0 cm和5.245 0 cm，且這三個(gè)水平之間沒(méi)有顯著區(qū)別。料液比為1∶5（g∶mL）時(shí)，提取液的pH值為3.01，此時(shí)，對(duì)照組的抑菌圈直徑為0.930 0 cm，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果存在明顯干擾，而其余4組試驗(yàn)的對(duì)照組無(wú)明顯的抑菌效果；綜合考慮，料液比為1∶3（g∶mL）比較適宜。

2.1.3 超聲處理時(shí)間的選擇

圖3 不同超聲時(shí)間對(duì)大腸桿菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)抑菌效果的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic time on antibacterial effect ofEscherichia coli(A)andStaphylococcus aureus(B)

由圖3可知，在0～20 min的范圍內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的增加，提取的草魚腸道抗菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的抑菌效果呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，且增加的趨勢(shì)較為平緩；超聲時(shí)間20 min時(shí)，大腸桿菌的抑菌圈直徑均值最大，為1.740 5 cm；超聲時(shí)間為30 min時(shí)，大腸桿菌的抑菌圈直徑均值最小，為1.272 5 cm，這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致了抗菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，使其活性反而降低。在0～20 min的范圍內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的增加，金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均值呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；20～40 min的范圍內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的增加，抑菌圈直徑較平穩(wěn)；不經(jīng)過(guò)超聲處理時(shí)，提取的草魚腸道抗菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑均值為4.228 0 cm，明顯優(yōu)于超聲處理組。

超聲在促進(jìn)抗菌物質(zhì)的溶解時(shí)，也有可能破壞抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而降低其活性。因此，在超聲處理試驗(yàn)中才會(huì)出現(xiàn)隨時(shí)間變化，抑菌圈直徑變化的不規(guī)律性或出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。此5組試驗(yàn)的對(duì)照組的抑菌圈直徑均在0.800 0 cm以內(nèi)（濾紙片的直徑為0.600 0 cm），而試驗(yàn)組抑菌圈最低是1.272 5 cm，最高是4.228 0 cm，可判斷抑菌效果主要來(lái)自提取液中的抗菌活性物質(zhì)。且綜合考慮，超聲處理10～20 min較適宜。

2.2 草魚腸道提取物中抗菌物質(zhì)的初步鑒定

草魚腸道抗菌物質(zhì)的提取液紫外光譜都是在200 nm附近有強(qiáng)吸收帶，且在250～300 nm出現(xiàn)了吸收帶，可能含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)。色氨酸的吲哚環(huán)在274.8 nm有較強(qiáng)吸收，酪氨酸的酚基最大吸收峰在280.4 nm處，胱氨酸對(duì)280 nm處的吸收值也有貢獻(xiàn)，組氨酸的吲哚環(huán)在250～260 nm有中等強(qiáng)度吸收帶，苯丙氨酸在247 nm、252nm、258 nm和264 nm處有4個(gè)小峰。因此，根據(jù)多肽和蛋白質(zhì)的紫外吸收特點(diǎn)，可推測(cè)試驗(yàn)組提取的草魚腸道抗菌物質(zhì)為多肽或蛋白質(zhì)成分。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件

按L9（33）進(jìn)行正交試驗(yàn)，主要以金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行比較與分析，以大腸桿菌抑菌圈直徑為輔助參考，結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

由表2可知，以金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)結(jié)果影響作用大小為乙酸體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞超聲時(shí)間。最佳提取條件為A3B2C2，即乙酸體積分?jǐn)?shù)10%，料液比1∶3.5（g∶mL），超聲時(shí)間10 min。在此優(yōu)化條件下，提取的草魚腸道抗菌物質(zhì)抗菌活性較高，其中金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為3.1060cm，大腸桿菌抑菌圈直徑為2.0284 cm。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，陽(yáng)離子型抗菌肽與微生物細(xì)胞膜上的陰離子作用，使細(xì)胞膜的離子通道打開，細(xì)胞內(nèi)滲透壓發(fā)生變化，這可能是試驗(yàn)提取的草魚腸道抗菌物質(zhì)能夠抑菌的主要原因[18]。

表3 以金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results using antibacterial circle diameter ofStaphylococcus aureus as evaluation index

由表3可知，在此次試驗(yàn)3個(gè)因素的3個(gè)水平范圍內(nèi)，乙酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響（P＜0.05）；料液比和超聲時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著。這是因?yàn)橐宜嵊欣谝志钚晕镔|(zhì)的溶解，并為抑菌活性物質(zhì)提供酸性環(huán)境，從而保持了其較好的抑菌活性。

2.4 粗提液蛋白質(zhì)含量

以牛血清白蛋白為標(biāo)樣，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見(jiàn)圖4。按乙酸的體積分?jǐn)?shù)為10%，料液比1∶3.5（g∶mL），超聲時(shí)間10 min，4 ℃浸提24 h，20 000×g離心20 min的方法得到的上清液按Bradford法測(cè)得的吸光度值為0.203，即對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量為252 μg/mL。

圖4 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of bovine serum albumin

3 結(jié)論

采用乙酸法提取草魚腸道抗菌物質(zhì)，影響草魚腸道抗菌物質(zhì)初步提取的主次因素依次為：乙酸體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞超聲時(shí)間。最終確定草魚腸道抗菌物質(zhì)的初步提取工藝組合為A3B2C2：即乙酸體積分?jǐn)?shù)10%，料液比1∶3.5（g∶mL），超聲時(shí)間10 min，4 ℃浸提24 h，按此條件提取的抗菌液，蛋白質(zhì)含量為252 μg/mL，抗菌活性較高，其中金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為3.106 0 cm，大腸桿菌抑菌圈直徑為2.028 4 cm。

[1]趙喜紅，何小維，羅志剛，等.抗菌肽的生物活性、作用機(jī)制及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2007，26（4）：1-5.

[2]DE LATOUR F A,AMER L S,PAPANSTASIOU E A,et al.Antimicrobial activity of theNaja atracathelicidin and related small peptides[J].Biochem Bioph Res Co,2010,396(4):825-830.

[3]袁永俊，胡 婷，朱家驊，等.酪蛋白抗菌肽的酶法制備[J].食品與機(jī)械，2010，26（2）：1-4.

[4]HWANG B,HWANG J S,LEE J,et al.Induction of yeast apoptosis by an antimicrobial peptide,Papiliocin[J].Biochem Bioph Res Co,2011,408(1):89-93.

[5]CHEN H M,WANG W,SMITH D,et al.Effects of the anti-bacterial peptide cecropin B and its analogs,cecropins B-1 and B-2,on liposomes,bacteria,and cancer cells[J].BBA-Gen Subjects,1997,1336(2):171-179.

[6]RIEDL S,ZWEYTICK D,LOHNER K.Membrane-active host defense peptides-challenges and perspectives for the development of novel anticancer drugs[J].Chem Phys Lipids,2011,164(8):766-781.

[7]LIN M C,HUI C F,CHEN J Y,et al.The antimicrobial peptide,shrimp anti-lipopolysaccharide factor(SALF),inhibits proinflammatory cytokine expressions through the MAPK and NF-κB pathways inTrichomonas vaginalisadherent to HeLa cells[J].Peptides,2012,38(2):197-207.

[8]BARONI A,PERFETTO B,CANOZO N,et al.Bombesin:a possible role in wound repair[J].Peptides,2008,29(7):1157-1166.

[9]OVCHINNIKOVA T V,BALANDIN S V,ALESHINA G M,et al.Aurelin,a novel antimicrobial peptide from jellyfishAurelia auritawith structural features of defensins and channel-blocking toxins[J].Biochem Bioph Res Co,2006,348(7):514-523.

[10]YEDERY R D,REDDY K V R.Purification and characterization of antibacterial proteins from granular hemocytes of Indian mud crab,Scylla serrata[J].Acta Biochim Pol,2009,56(1):71-82.

[11]CHARLET M,CHERNYSH S,PHILIPPE H,et al.Innate immunity isolation of several cysteine-rich antimicrobial peptides from the blood of a mollusc,Mytilus edulis[J].J Biol Chem,1996,271(36):21808-21813.

[12]韓俊友.牛蛙皮膚抗菌肽分離純化，基因克隆表達(dá)及生物學(xué)特性的研究[D].吉林：吉林大學(xué)博士論文，2007.

[13]LI C,HAUG T,MOE M K,et al.Centrocins:Isolation and characterization of novel dimeric antimicrobial peptides from the green sea urchin,Strongylocentrotus droebachiensis[J].Dev Comp Immunol,2010,34(9):959-968.

[14]蘇建明.草魚腸道組織消減cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建及免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2007.

[15]張學(xué)俊，屈 剛，朱文漓，等.草魚腸道cDNA 文庫(kù)構(gòu)建及部分ESTs分析[J].水生生物學(xué)報(bào)，2007，31（2）：251-258.

[16]史玉婷.草魚腸道β-防御素克隆表達(dá)及抗菌活性分析[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2012.

[17]王金亭，方 俊.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].武漢：華中科技大學(xué)出版社，2010.

[18]OUELLET M,OTIS F,VOYER N,et al.Biophysical studies of the interactions between 14-mer and 21-mer model amphipathic peptides and membranes:Insights on their modes of action[J].BBA-Biomembranes,2006,1758(9):1235-1244.