楊 慧，賈文婷，吳 宏，吳洪斌，金新文*

（新疆農(nóng)墾科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 新疆農(nóng)墾科學院農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室 石河子 832000）

葡萄是一種世界性的水果，富含糖、氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分，因其營養(yǎng)價值高，被譽為“世界水果的明珠”[1-2]。無核紫葡萄（Vitis romanetiiRom.Caill.）別名無核黑、馬紐卡（Monukka），屬中晚熟品種，抗寒性、抗病性良好。果穗圓錐形，果皮呈紫紅色，皮薄肉脆、肉質(zhì)細膩、酸甜可口，可溶性固形物含量18%～21%，屬鮮食、制干、制汁多用的優(yōu)新品種，該品種現(xiàn)已在新疆大面積推廣[3-4]。目前新疆無核紫葡萄主要用于鮮食和制干[3-5]。

花青素（anthocyanidin）又稱花色素，屬黃酮類化合物，是一類廣泛分布在自然界中的多酚化合物，在植物的根、葉、莖和果實中廣泛存在。在自然狀態(tài)下，花青素在植物體內(nèi)常與各種單糖結合形成糖苷，稱為花色苷。1853年，由Marguart用來命名矢車菊花朵中的藍色提取物，現(xiàn)在作為同類物質(zhì)的總稱[6]。花青素具有防止腦神經(jīng)老化、清除體內(nèi)自由基、保護視力等多種生理活性功能[7]。目前對花青素的提取方法主要有溶劑提取法、超聲提取法、超臨界二氧化碳提取法[8-10]。超聲提取法具有明顯的優(yōu)勢，其強烈的空化效應、局部高溫和高加速度能使細胞壁的通透性提高，加速花青素進入溶劑，提高提取率[11-14]。本試驗用超聲波技術輔助乙醇法浸提無核紫葡萄中的花青素，以獲得較高純度的花青素，以期使新疆無核紫葡萄資源得到更充分利用，為新疆無核紫葡萄深加工和綜合利用提供理論依據(jù)和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮無核紫葡萄：購自于石河子市果蔬批發(fā)市場。

HCl、KCl、CH3COONa和無水乙醇（均為分析純）：上?；瘜W試劑有限公司。

pH 1.0 HCl-KCl緩沖液、pH 4.5 HCl-CH3COONa緩沖液、5%HCl-CH3CH2OH溶液：實驗室配制[15]。

1.2 儀器與設備

DFY-500型高速萬能粉碎機：浙江溫嶺市林大機械有限公司；Neofuge 13臺式高速離心機：力康發(fā)展有限公司；BSA-CW型萬分之一天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV 2600型紫外可見分光光度計：日本島津有限公司；R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海爾道夫公司；KQ-100DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 無核紫葡萄中花青素提取工藝及操作要點

無核紫葡萄→預處理→粉碎→超聲波浸提→離心→上清液→定容→花青素測定

操作要點：將購買的新鮮無核紫葡萄去柄，用蒸餾水洗凈，瀝干待用。稱取預處理過的無核紫葡萄100 g，用高速粉碎機粉碎，精確稱取1.000 0 g無核紫葡萄勻漿于100 mL三角瓶中，按照不同的料液比、提取溫度、提取時間和乙醇體積分數(shù)設計試驗在180 W超聲功率條件下進行超聲波提取，在4 000 r/min條件下旋轉(zhuǎn)離心，得到澄清的色素上清液。取2 mL上清液，用5%HCl-CH3CH2OH稀釋定容至100 mL，分別移取10 mL，用pH 1.0 HCl-KCl緩沖液和pH 4.5 HCl-CH3COONa緩沖液稀釋至100 mL，靜置一段時間，測定花青素含量。

1.3.2 無核紫葡萄花青素的光譜分析

將無核紫葡萄花青素提取液在波長450～600 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描分析，得出無核紫葡萄花青素的吸收光譜圖，以確定最大吸收波長。

1.3.3 無核紫花青素含量及其得率測定

用pH示差法原理對無核紫葡萄中花青素進行定量分析。pH示差法原理是花青素發(fā)色團的結構轉(zhuǎn)換是pH的函數(shù)，而起干擾作用的褐色降解物的特性不隨pH變化。結合朗伯-比爾定律，在花青素最大吸收波長下pH 1.0和pH 4.5的花青素溶液的吸光度值差值與花青素的含量成比例。根據(jù)FULEKI T的經(jīng)驗公式[16]可計算出無核紫葡萄中的花青素含量。試驗以蒸餾水作空白，計算公式如下：

式（1）中：C為無核紫葡萄提取液花青素含量，g/L；A表示吸光度值，由式（2）換算得來；ε為摩爾消光系數(shù)，26 900；L為比色皿光程，1 cm；MW為花青素分子質(zhì)量，449.2；DF為稀釋倍數(shù)50。

式（2）中：A700用來抵消無核紫葡萄樣液渾濁的影響。

式（3）中：V為無核紫葡萄提取液體積，mL；M為無核紫葡萄質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗設計

乙醇體積分數(shù)的確定：分別選擇乙醇體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%，在料液比1∶20（g∶mL），提取溫度50 ℃條件下提取50 min，測定無核紫葡萄花青素含量及其得率。

料液比的確定：料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL），在乙醇體積分數(shù)為70%、提取溫度50 ℃條件下提取50 min，測定無核紫葡萄花青素含量及其得率。

提取溫度的確定：提取溫度分別為30 ℃、40 ℃、50℃、60 ℃、70 ℃，在乙醇體積分數(shù)為70%、料液比1∶20（g∶mL）條件下提取50 min，測定無核紫葡萄花青素含量及其得率。

提取時間的確定：分別設定提取時間為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，在乙醇體積分數(shù)為70%、料液比1∶20（g∶mL），提取溫度50 ℃條件下提取，測定無核紫葡萄花青素含量及其得率。

1.3.5 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間4個對無核紫葡萄提取率影響顯著的因素，進行L9（34）正交試驗，以花青素得率為評價指標，最終確定新疆無核紫葡萄花青素提取的最佳工藝條件。正交試驗設計因素與水平見表1。

表1 花青素提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for anthocyanin extraction conditions optimization

2 結果與分析

2.1 無核紫葡萄在可見光區(qū)的最大吸收波長的確定

將無核紫葡萄提取液在波長450～600 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，結果見圖1。由圖1可知，無核紫葡萄花青素的最大吸收波長為510 nm。

圖1 無核紫葡萄花青素吸收光譜Fig.1 Absorption spectrogram of anthocyanin Monukka grapes

2.2 各因素對提取效果的影響

2.2.1 不同乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響

不同乙醇體積分數(shù)條件下的花青素得率如圖2所示。

由圖2可知，不同的乙醇體積分數(shù)對花青素提取效果有顯著影響，乙醇體積分數(shù)60%時得率最高。但隨著乙醇體積分數(shù)繼續(xù)升高，花青素的得率逐漸降低，原因可能是花青素具有兩性特征，即其結構中含有顯酸性的酚羥基和顯堿性的四價氧原子，致使花青素穩(wěn)定性受pH值變化影響較大，pH值過高或過低都會直接影響色素的提取效果，因此選擇乙醇最佳體積分數(shù)為60%。

圖2 乙醇體積分數(shù)對花青素得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on anthocyanln yield

2.2.2 料液比對花青素提取效果的影響

不同料液比條件下的花青素得率如圖3所示。

圖3 料液比對花青素得率的影響Fig.3 Effect of solid liquid ratio on anthocyanln yield

由圖3可以看出，當料液比＜1∶20（g∶mL）時，花青素得率隨料液比的增加而增加，料液比＞1∶20（g∶mL）時，得率極速下降后趨于平穩(wěn)。說明料液比過大，溶劑中含有大量的乙醇，與固體物料接觸機率增大，極性減小，不利于花青素的提取。因此選取1∶20（g∶mL）為最佳料液比。

2.2.3 提取時間對花青素提取效果的影響

不同提取溫度條件下的花青素得率如圖4所示。

圖4 溫度對花青素得率的影響Fig.4 Effect of temperature on anthocyanln yield

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，花青素得率逐漸增大，溫度達到60 ℃時花青素得率最大，當溫度＞60 ℃后，花青素得率迅速降低，原因可能是溫度過高使花青素穩(wěn)定性降低，導致花青素降解。故選取最佳提取溫度為60 ℃。

2.2.4 提取時間對花青素提取效果的影響

不同提取時間的花青素得率如圖5所示。

圖5 提取時間對花青素得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on anthocyanln yield

由圖5可知，提取時間40 min時花青素得率最高，為2.85%，隨著提取時間的延長，花青素得率開始降低，原因可能是超聲波具有較強的機械剪切作用，長時間作用會破壞花青素的內(nèi)部結構，導致花青素降解。因此提取時間為40 min最為合適。

2.3 提取無核紫葡萄花青素的最佳工藝

在單因素試驗的基礎上，對乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、提取時間進行L9（34）正交試驗，試驗設計及分析結果見表2，方差分析見表3。

表2 花青素提取條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments foranthocyanin extraction conditions optimization

從表2極差分析結果可以看出，乙醇體積分數(shù)的極差最大，其次是提取溫度、料液比、提取時間，可見影響無核紫葡萄花青素得率的因素主次順序為A＞C＞B＞D，即乙醇體積分數(shù)＞提取溫度＞料液比＞提取時間。無核紫葡萄花青素超聲提取的最佳工藝組合為A3B1C1D2，即乙醇體積分數(shù)為65%、料液比為1∶15（g∶mL）、提取溫度為50 ℃、提取時間為40 min。在此條件下進行3次驗證試驗，結果無核紫葡萄花青素平均得率為3.35%，高于正交試驗表中最大得率3.19%，故可認為該組合為超聲波輔助法提取無核紫葡萄花青素的最佳提取工藝。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis results of orthogonal experiments

由表3方差分析可知，乙醇體積分數(shù)、提取溫度和料液比均為顯著因素，而提取時間在試驗設計水平下為不顯著因素。原因可能是超聲波強烈的空化效應和機械剪切作用，提取30～50 min已經(jīng)超過了限度，提取效果已達最大化，因此可以推論無核紫葡萄花青素提取時間應該控制在40 min以內(nèi)。

2.4 對比試驗

為了考察超聲波輔助乙醇法提取無核紫葡萄花青素的得率，該文將其與傳統(tǒng)乙醇浸提法進行了對比試驗，結果如表4所示。

表4 無核紫葡萄花青素兩種提取方法的比較Table 4 Comparison of two extraction methods of anthocyanin from Monukka grape

從表4可以看出，與傳統(tǒng)乙醇法相比，超聲波輔助乙醇法浸提無核紫葡萄花青素得率提高了20.5%，說明超聲波技術能有效促進無核紫葡萄花青素的提取。

3 結論

單因素試驗結果表明，新疆無核紫葡萄花青素超聲提取過程中受乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度和提取時間4個因素影響較大，且各因素水平數(shù)據(jù)之間存在一定的梯度差。正交試驗結果表明，無核紫葡萄中花青素最佳提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)65%、料液比1∶15（g∶mL）、提取溫度50 ℃、提取時間40 min。此條件下花青素平均得率為3.35%。對比試驗結果表明，超聲波輔助乙醇法較傳統(tǒng)乙醇法浸提效果好，花青素得率提高了20.5%。

利用超聲波技術輔助乙醇法提取無核紫葡萄花青素具有節(jié)約時間、能耗低、提取率高等優(yōu)點，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)無核紫葡萄花青素的提供理論基礎。

[1]喬憲生.中國葡萄及其加工品貿(mào)易現(xiàn)狀與發(fā)展方向[J].中國食物與營養(yǎng)，2004（3）：27-31.

[2]XU X Q,CHENG G,DUAN L L,et al.Effect of training systems on fatty acids and their derived volatiles in Cabernet Sauvignon grapes and wines of the north foot of Mt.Tianshan[J].Food Chem,2015,181(15):198-206.

[3]楊文俠，高振江，譚紅梅，等.氣體射流沖擊干燥無核紫葡萄及品質(zhì)分析[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2009，25（4）：237-242.

[4]SINGH S P,JAIRAJ K S,SRIKANT K.Universal drying rate constant of seedless grapes:A review[J].Renew Sust Energ Rev,2012,16(8):6295-6302.

[5]周曉明，韓立群.新疆不同葡萄品種制干前后果重及果形變化的研究[J].中國農(nóng)學通報，2013，29（18）：187-192.

[6]亓 偉，張亓伊雯，格日勒.釀酒葡萄渣粕原花青素提取工藝研究[J].中國釀造，2014，33（5）：137-141.

[7]徐亞偉，于曉明，張 欣.水蠟樹果中原花青素的最佳提取工藝研究[J].北方園藝，2010，22（35）：45-47.

[8]鄭先哲，陶 巖，李秀偉，等.微波萃取藍莓中花青素獲取和降解的同步模型[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2014，45（11）：108-115.

[9]顧焰波，譚曉艷，江 冰.纖維素輔助提取蘋果皮中原花青素的工藝研究[J].中國食品添加劑，2014（6）：102-106.

[10]姜貴全，方桂珍，張卓睿，等.超臨界CO2輔助-超聲波強化對落葉松樹皮原花青素提取工藝的研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（18）：257-261.

[11]柯春林，郭 猛，王 娣，等.蔓越莓原花青素的提取工藝及其體外抗氧化活性研究[J].應用化工，2015（1）：81-84.

[12]李 璐，倪婷婷，關文玉，等.基于響應面法提取“紫鵑”茶花青素最佳工藝的優(yōu)化研究[J].2014，27（4）：1704-1706.

[13]張莉弘，吳 瓊，牟 莉，等.藍莓花青素的提取工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（15）：49-51.

[14]NICOLETTI I,BELLO C,DE ROSSI A.Identification and quantification of phenolic compounds in grapes by HPLC-PDA-ESI-MS on a semim-icroseparation scale[J].J Agr Food Chem,2008,56(19):8801-8808.

[15]楊兆艷.pH 示差法測定桑椹紅色素中花青素含量的研究[J].食品科技，2007（4）：201-202.

[16]FULEKI T,FRANCIS F J.Quantitative method for anthocyanins 2 determination of total antocyanin and degraiton index for cranberry juice[J].Food Sci,1968,33:78-83.