趙 穎, 于 飛, 郭明敏, 卜 寧

(沈陽(yáng)師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034)

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堿蓬內(nèi)生真菌JP3的分離、鑒定及促生作用研究

趙 穎, 于 飛, 郭明敏, 卜 寧

(沈陽(yáng)師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034)

為研究鹽生堿蓬(Suaedaglauca)植物體內(nèi)生菌及其產(chǎn)生的生物學(xué)活性物質(zhì)對(duì)植物的促生長(zhǎng)作用,利用組織分離法對(duì)堿蓬內(nèi)生菌進(jìn)行分離;用水培法測(cè)定堿蓬內(nèi)生真菌對(duì)水稻幼苗株高、干重、葉綠素含量等生理指標(biāo)的影響;對(duì)具有明顯促生活性的菌株根據(jù)形態(tài)、培養(yǎng)特征和18SrDNA測(cè)序分析進(jìn)行分類鑒定。從健康堿蓬植株的根、莖、葉中分別分離出19株、70株和49株,共138株內(nèi)生菌,其中細(xì)菌13株、真菌122株、放線菌3株;篩選出對(duì)水稻幼苗具明顯促生活性的真菌JP3,由該菌處理的水稻幼苗與對(duì)照相比其干重增加12.23%,株高增加15.6%(P<0.05),總?cè)~綠素含量增加了13.2%;18SrDNA測(cè)序和比對(duì)結(jié)果顯示JP3屬Glomerellacingulata,相似性大于97%。研究表明:堿蓬植物內(nèi)生菌具有豐富、多樣的特點(diǎn),是產(chǎn)生促生物學(xué)活性物質(zhì)的重要微生物資源,可為開(kāi)發(fā)新的植物促生劑提供生物源物質(zhì)。

堿蓬內(nèi)生真菌; 分離; 鑒定; 促生作用

0 引 言

植物內(nèi)生菌是一類重要的微生物資源,有關(guān)植物內(nèi)生菌與植物間的互作影響及其機(jī)制的研究已越來(lái)越引起人們的關(guān)注[1-2]。有研究表明,感染內(nèi)生菌的植株比未感染的植株往往具有生長(zhǎng)速度更快、對(duì)逆境的抵抗能力更強(qiáng)、對(duì)病蟲(chóng)害的抵抗力強(qiáng),具有更強(qiáng)的生存競(jìng)爭(zhēng)力[3]。微生物肥料具有肥效高、本身無(wú)毒、不污染環(huán)境且成本低等特點(diǎn),是比較理想的替代品,因此,合理開(kāi)發(fā)和利用微生物肥料,尤其是開(kāi)發(fā)內(nèi)生菌資源,是提高作物的產(chǎn)量和促進(jìn)農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要途徑[4]。

土壤鹽堿化使植物葉綠素含量、凈光合速率以及水分利用效率等逐漸降低,是制約我國(guó)農(nóng)作物產(chǎn)量的主要因素之一[5]。堿蓬(Suaeda salsa)是一種生長(zhǎng)于鹽堿地和海濱沙灘的耐鹽性極強(qiáng)的鹽生植物,在我國(guó)分布廣泛,是當(dāng)前生物改良鹽漬土的首選植物品種[6]。長(zhǎng)期以來(lái),由于受鹽漬化土壤是“生命禁區(qū)”思想的禁錮,對(duì)鹽漬化極端生態(tài)下的微生物尤其是處于該環(huán)境下的植物內(nèi)生菌研究、開(kāi)發(fā)與利用很少有人問(wèn)津。本研究從遼寧省盤(pán)錦市紅海灘自然保護(hù)區(qū)的堿蓬植株中分離獲得了內(nèi)生菌,并對(duì)其中的促生活性菌株進(jìn)行了篩選鑒定,旨在為進(jìn)一步研究及開(kāi)發(fā)堿蓬內(nèi)生菌資源提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 鹽生堿蓬(Suaeda glauca bge),于10月份采于遼寧省盤(pán)錦市紅海灘濕地自然保護(hù)區(qū)。

1.1.2 供試水稻(Oryza sativa L.) 遼星1號(hào),由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 堿蓬內(nèi)生真菌的分離純化

采用組織塊法[7]對(duì)堿蓬內(nèi)生真菌進(jìn)行分離。 取新鮮、無(wú)蟲(chóng)害的健康堿蓬組織用自來(lái)水洗凈, 并用無(wú)菌紙吸干水分, 切掉須根,切取主根、莖成1.0 cm長(zhǎng)的小段, 葉保留完整,進(jìn)行表面消毒處理[8]: 用無(wú)菌水沖洗3～4遍, 75%酒精浸泡1 min, 無(wú)菌水沖洗3～4次, 在用0.1%升汞浸泡5 min, 無(wú)菌水沖洗4～5次。 樣品用無(wú)菌吸水紙吸干后備用。 將待分離的組織用無(wú)菌手術(shù)刀切成0.5～1.0 cm大小, 置PDA平板上, 25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 根據(jù)菌落形態(tài)挑取不同真菌然后進(jìn)行純化并接種于PDA斜面培養(yǎng)基上, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?吸取50 μL最后一次洗滌水涂布在PDA平板上, 至于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 作為空白對(duì)照。

1.2.2 篩選

1.2.2.1 堿蓬內(nèi)生菌對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)材料選取子粒飽滿整齊的水稻種子,于28 ℃恒溫箱浸種24 h后,于30 ℃時(shí)催芽24 h。取發(fā)芽的水稻種子,整齊的擺放在含紗網(wǎng)的塑料燒杯上,燒杯內(nèi)裝滿Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培。于人工氣候箱(晝夜溫度28 ℃/26℃;光照16 h;80%相對(duì)濕度;光強(qiáng)3 000 lux)中培養(yǎng)4 d,生長(zhǎng)過(guò)程中每天定時(shí)定量補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液。4 d后用培養(yǎng)9 d的內(nèi)生真菌及發(fā)酵液30 mL處理水稻幼苗,各處理重復(fù)3次,對(duì)照則加30 mL的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)5 d后從每盆隨機(jī)抽取幼苗10株,洗凈根系,用直尺測(cè)量其株高。80 ℃烘干至恒重,精確稱量水稻的干重,詳細(xì)記錄數(shù)值。

1.2.2.2 堿蓬內(nèi)生菌對(duì)水稻幼苗葉綠素含量的影響

用丙酮乙醇混合液法提取葉綠素,將丙酮乙醇按1∶1比例配成混合浸提液,備用。稱取0.1 g葉片,切碎置于離心管中,加入5 mL混合液,置于暗處,于室溫條件下浸提24 h。用混合浸提液作空白調(diào)零,測(cè)645、670、663 nm處的吸光度。

1.2.3 堿蓬內(nèi)生真菌JP3的鑒定

篩選出的的優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定。使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA作為PCR模版。以18S-ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和18S-ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′為引物進(jìn)行擴(kuò)增。將測(cè)得的18SrDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿蓬內(nèi)生菌分離純化

圖1 堿蓬組織塊(根)中分離的植物內(nèi)生真菌

采用組織塊分離法從健康堿蓬植物的根、莖、葉中共分離到138株內(nèi)生菌(圖1), 其中細(xì)菌13株、真菌122株、放線菌3株; 根、莖、葉中分別分離得到內(nèi)生菌19株, 70株, 49株, 分別占內(nèi)生菌總數(shù)的13.8%、50.7%和35.5%。 由此可知, 堿蓬組織中內(nèi)生菌的分布有所差異, 莖中內(nèi)生菌數(shù)量最多; 內(nèi)生真菌在數(shù)量上占有較大的優(yōu)勢(shì), 內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌相對(duì)較少。

2.2 促生活性內(nèi)生真菌的篩選

2.2.1 堿蓬內(nèi)生菌對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的影響

菌株及發(fā)酵液對(duì)水稻幼苗的促生作用見(jiàn)圖2,從122株內(nèi)生真菌中篩選出3株對(duì)水稻幼苗的長(zhǎng)勢(shì)有明顯促進(jìn)作用的內(nèi)生真菌:JP3、JP4和JP2。三株菌處理水稻幼苗后,水稻的高度明顯大于對(duì)照組CK。水稻幼苗在培養(yǎng)10 d后,測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組水稻幼苗的株高和干重(結(jié)果見(jiàn)表1)。由表1可知, JP3和JP4菌株發(fā)酵液處理的水稻幼苗干重與對(duì)照的差異顯著,提高幅度分別為12.23%及8.93%,而JP2菌株發(fā)酵液處理的水稻干重差異不顯著,提高幅度為7.84%;3種內(nèi)生真菌處理的水稻株高與對(duì)照的差異顯著,提高幅度分別15.6%、14.2%和12.8%。

圖2 菌株及發(fā)酵液對(duì)水稻幼苗的促生作用

表1 3株堿蓬內(nèi)生菌對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)組別株高/cm干重/gCK16．71±0．65c0．098±0．004bJP319．32±1．33b0．110±0．002aJP420．87±0．74a0．107±0．005aJP218．98±1．09b0．105±0．06ab

注:表中數(shù)值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,不同的字母代表不同的顯著性差異(Duncan-test,P<0.05)。

圖3 對(duì)水稻幼苗葉片葉綠素含量的影響(Duncan-test,P<0.05)

2.2.2 堿蓬內(nèi)生菌對(duì)水稻幼苗葉片葉綠素含量的影響

由圖3可以看出, JP3、JP4和JP2處理的水稻葉片葉綠素a、葉綠素b含量及二者總含量(以鮮質(zhì)量計(jì))均有升高,葉綠素b及總?cè)~綠素含量與不加菌處理的對(duì)照差異顯著,提高幅度分別為 23.1%、27.6%和24.3%;13.2%、16.8%和14.5%,而葉綠素a差異不顯著,提高幅度分別為10.7%、12.9%和12.1%。發(fā)酵液處理后,葉綠素b的變化幅度及差異性明顯高于葉綠素 a,說(shuō)明堿蓬內(nèi)生菌對(duì)葉綠素a和b的影響有差異。

2.3 堿蓬內(nèi)生真菌JP3的鑒定結(jié)果

形態(tài)學(xué)鑒定:內(nèi)生菌的培養(yǎng)形態(tài)及顯微觀察結(jié)果如圖4所示。JP3在PDA培養(yǎng)基上平均生長(zhǎng)速度約為6 mm·d-1。菌落初呈白色,后中心粉紅,外層為白色,菌落表面有黑色輻射狀溝紋,有紅色色素產(chǎn)生。菌落致密,基質(zhì)反面黑紅色,菌落表面有透明液體狀滲出物,菌絲表面光滑。在光學(xué)顯微鏡下菌絲無(wú)色,分枝,有橫隔,自發(fā)地形成以特殊的菌絲變態(tài)形成的捕食器官收縮環(huán)。

(a)—Y11的菌落; (b)—Y11的菌絲形態(tài)(100×); (c)、(d)—Y 11的菌絲形態(tài)(400×)。

JP3菌株18SrDNA序列擴(kuò)增和序列分析比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2, NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與菌株JP3相似度較高的菌株均屬Glomerella sp.其中模式種Glomerella cingulata與菌株JP3的相似性達(dá)到了99%(圖5)。

表2 具促生活性的堿蓬內(nèi)生真菌的18SrDNA比對(duì)結(jié)果

圖5 基于18SrDNA序列的JP3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討 論

目前,關(guān)于鹽地堿蓬植物內(nèi)生菌的相關(guān)研究的報(bào)道很少。遼寧盤(pán)錦紅海灘堿蓬長(zhǎng)期生長(zhǎng)在高鹽的特殊環(huán)境中。本研究對(duì)鹽生堿蓬的內(nèi)生菌進(jìn)行了分離和鑒定,結(jié)果表明,盡管堿蓬體內(nèi)鹽濃度很高,在一定程度上限制了內(nèi)生菌的數(shù)量及種類,但在其體內(nèi)仍然存在豐富的內(nèi)生菌資源,本次研究先后共分離得到138株堿蓬內(nèi)生菌,其中以莖中最多,其次為葉,而根中最少。這一特點(diǎn)與鈕旭光等[9]分離的堿蓬內(nèi)生菌的數(shù)量分布為根內(nèi)最多,其次是莖和葉片的分布規(guī)律不同,可能是由于不同地區(qū)、不同品種、不同分離時(shí)期所分離的內(nèi)生菌數(shù)量不同。

堿蓬體內(nèi)高鹽環(huán)境中的微生物與植物長(zhǎng)期共同進(jìn)化的過(guò)程中可能形成某些代謝機(jī)制或者產(chǎn)生某些代謝產(chǎn)物使植物能夠適應(yīng)鹽堿的極端環(huán)境, 促進(jìn)宿主生長(zhǎng), 現(xiàn)有的文獻(xiàn)在這方面已有報(bào)道, 涉及農(nóng)作物、蔬菜及水果等各個(gè)領(lǐng)域[10-15]。 本試驗(yàn)結(jié)果表明, 從堿蓬中分離得到的JP3菌株對(duì)水稻幼苗的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用, 菌株發(fā)酵液處理組比對(duì)照組的水稻幼苗健壯、葉色濃綠、植株高、干物質(zhì)的積累增加。

本研究對(duì)所分離得到的堿蓬內(nèi)生菌進(jìn)行了分離鑒定, 結(jié)果表明鹽生堿蓬體內(nèi)存在豐富的內(nèi)生菌資源, 但在篩選功能促生活性菌株所采用的方法比較繁雜,工作量大, 在研究中應(yīng)找到更為有效和簡(jiǎn)便的方法來(lái)對(duì)堿蓬內(nèi)生菌資源進(jìn)行挖掘和深入研究, 例如采用ACC為唯一的氮源快速篩選具有ACC脫氨酶活性的菌株[16]研究這類菌株的促生活性, 這將為內(nèi)生菌對(duì)植物的促生機(jī)制方面提供新的思路。

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Isolation, identification and growth-promoting effect ofSuaedasalsaendophyte fungus JP3

ZHAOYing,YUFei,GUOMingmin,BUNing

(College of Chemistry and Life Science,Shenyang Normal University, Shenyang 110034,China)

Endophytes were isolated fromSuaedasalsaby tissue isolation to study the effects on promoting plant growth.Hydroponic experiments were carried out to study the role of endophyte fungi on rice seedling growth.Rice shoot height, dry weight and chlorophyll (Chl) content were determined.Strains were identificated according to endophytes morphology, characteristic and 18S rDNA sequencing results.138 endophytes were isolated from the roots (19 endophytes), stems (70 endophytes) and leaves (49 endophytes) ofSuaedaglauca, respectively, including 13 endophyte bacteria, 122 endophyte fungi and 3 endophyte actinomyces.Endophyte fungus JP3 which promoting rice seedling growth was screened.Shoot length, dry weight and chlorophyll (Chl) content of rice treated with endophyte fungus JP3 were significantly increased by 15.6%, 12.23% and 13.2%, respectively of the control.Endophyte fungus JP3 belonged toGlomerellacingulatafamily and had 97% similarity to otherGlomerellaspstrains according to 18S rDNA sequencing results.The results showed that endophytes isolated fromSuaedaglaucahad the traits of rich and diversity, which were the important microorganism resources and supplied biological source substances to exploit new plant growth promoting agent.

Suaedasalsaendophyte fungi; isolation; identification; promoting growth effect

2014-08-17。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31270369); 沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心主任基金資助項(xiàng)目(SY201102)。

趙 穎(1989-),女,遼寧沈陽(yáng)人,沈陽(yáng)師范大學(xué)碩士研究生; 卜 寧(1960-),女,河北昌黎人,沈陽(yáng)師范大學(xué)教授,碩士研究生導(dǎo)師。

1673-5862(2015)01-0116-05

Q949.714.2; Q949.32

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2015.01.026