丁 明，張 迅，王 威，遲 蕾

術(shù)后認(rèn)知功能障礙 （postoperation cognitive dysfunction，POCD）是指麻醉手術(shù)后出現(xiàn)的一種焦慮、精神錯(cuò)亂、人格改變及記憶受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，并且老年患者發(fā)生率較高。研究推測(cè)，腦中特定區(qū)域的膽堿能神經(jīng)通路參與了老年人POCD的 發(fā) 生［1］。 粒 細(xì) 胞 集 落 刺 激 因 子 （granulocyte colony stimulating factor，G－CSF） 能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放，從而加強(qiáng)神經(jīng)芽殖、突觸發(fā)生、神經(jīng)傳遞以及神經(jīng)遞質(zhì)釋放［2］，研究表明，G－CSF在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭芯哂猩窠?jīng)保護(hù)作用［3］。常作為麻醉前用藥的東莨菪堿，因其具有抗膽堿作用，常被用來建立研究抗癡呆藥物的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用東莨菪堿致大鼠認(rèn)知障礙動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究G－CSF對(duì)抗膽堿藥引起的認(rèn)知障礙的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 氫溴酸東莨菪堿（上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)130401）；重組人粒細(xì)胞集落刺激因子 （山東齊魯制藥， 批號(hào)201305019TC）；PV－9001兔二步法檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；生物素化抗鼠IgG（武漢，博士德公司）；鼠抗ChAT多克隆抗體（武漢，博士德公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇及分組 10月齡的Wistar雄性大鼠24只 （山東濟(jì)寧魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量（480±30）g，分籠飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境，自由攝食攝水。實(shí)驗(yàn)前對(duì)大鼠使用Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）進(jìn)行水迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練兩次。隨機(jī)分三組：空白組（N組），東莨菪堿組（S組）和G－CSF干預(yù)組（G組），每組8只。N組腹腔注射生理鹽水1 ml，S組腹腔注射氫溴酸東莨菪堿1 mg／kg，G組腹腔注射氫溴酸東莨菪堿1 mg／kg后皮下注射G－CSF 50 μg／kg，連續(xù)5 d。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 行為學(xué)測(cè)試 于每天給藥3 h后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，測(cè)定大鼠從入水到爬上潛在平臺(tái)的時(shí)間（潛伏期）和總游泳路程。測(cè)試兩次取其平均值，兩次測(cè)試間隔1 h。

1.3.2 形態(tài)學(xué)檢查 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的灌注與取材大鼠末次水迷宮測(cè)試后，腹腔注射10%的水合氯醛3 ml／kg麻醉后暴露心臟，左心室內(nèi)注射1%肝素2 ml后經(jīng)左心室進(jìn)行主動(dòng)脈插管，絲線固定后右心耳處剪口，以400 ml生理鹽水快速?zèng)_洗血管，待肝臟顏色變?yōu)樯n白色并且無血液流出時(shí)，用4℃4%多聚甲醛灌注2 h，肢體尾部變硬后斷頭取腦，置入4%多聚甲醛中再固定24 h。將腦標(biāo)本乙醇系列脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟切片機(jī)切片，制成4 μm厚連續(xù)切片。②海馬區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）表達(dá)的測(cè)定 用免疫組化SP法測(cè)定ChAT的表達(dá)。鏡下觀察細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)染色，用計(jì)算機(jī)圖像系統(tǒng)分析攝片，測(cè)出陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組潛伏期天數(shù)比較 N、S、G三組不同天數(shù)間經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示潛伏期每一組不同天數(shù)間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步兩兩比較顯示，每一組中第3天與第1天間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；每一組中第5天與第1天見的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），潛伏期均較第1天縮短。見表1。

表1 各組大鼠不同天數(shù)潛伏期（s）的比較（±s，n＝8）

表1 各組大鼠不同天數(shù)潛伏期（s）的比較（±s，n＝8）

注：與第1天比較，ΔP＜0.05

組別 第1天 第3天 第5天 F P N組 84.50±7.43 41.50±6.95Δ 17.25±4.80Δ 220.067 0.000Δ S組 81.75±7.98 65.50±6.99Δ 40.75±6.61Δ 65.520 0.000Δ G組 85.13±7.26 45.38±5.04Δ 28.25±5.75Δ 183.780 0.000Δ F 0.451 32.509 33.251 － －P 0.643 0.000Δ 0.000Δ － －

2.2 各組游泳距離各天之間比較 N、S、G三組不同天數(shù)間經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示游泳距離的每一組不同天數(shù)間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步兩兩比較顯示，每一組中第3天與第1天間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；每一組中第5天與第1天見的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），游泳距離均較第1天縮短。見表2。

表2 各組大鼠不同天數(shù)游泳距離（cm）的比較（±s，n＝8）

表2 各組大鼠不同天數(shù)游泳距離（cm）的比較（±s，n＝8）

注：與第1天比較，ΔP＜0.05

組別 第1天 第3天 第5天 F P N組 1501.13±168.71 858.00±171.19Δ 356.63±91.28Δ 119.508 0.000Δ S組 1492.88±193.00 1126.00±170.94Δ 769.50±118.89Δ 38.785 0.000Δ G組 1665.50±273.93 915.25±164.90Δ 582.00±157.55Δ 58.179 0.000Δ F 1.613 5.577 21.689 － －P 0.223 0.011Δ 0.000Δ － －

2.3 各組ChAT陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)的比較 ChAT陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)在不同組間經(jīng)單因素方差分析后，結(jié)果顯示不同組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F＝43.049，P＝0.000＜0.05）， 進(jìn)一步兩兩比較可得，N組與S組，G組與S組間ChAT陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且細(xì)胞個(gè)數(shù)均低于S組。見表3。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)所有組間均符合方差齊性。

表3 各組ChAT陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)比較（±s）

表3 各組ChAT陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)比較（±s）

注：與S組比較，ΔP＜0.05

S組 8 32.63±4.37 G組 8 22.75±4.03Δ組別 樣本例數(shù) 個(gè)數(shù) F P N組 8 14.75±3.06Δ 43.049 0.000Δ

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)選用成年雄性大鼠，首先因?yàn)槔夏甏笫竽憠A能功能減退；其次，研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)元的功能、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)并改善認(rèn)知功能等［4］。

東莨菪堿是常見的抗膽堿藥，可以抑制中樞膽堿能通路功能。作為麻醉前用藥，其抑制腺體分泌作用強(qiáng)于阿托品等抗膽堿藥。東莨菪堿致大鼠認(rèn)知功能獲得性障礙模型是一種較為成熟的研究抗癡呆藥物的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果S組和N組相比，說明了該動(dòng)物模型造模理想，模擬了麻醉和手術(shù)后膽堿能系統(tǒng)功能改變。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的常用檢測(cè)方法，潛伏期和游泳距離可以反映大鼠認(rèn)知功能的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，G－CSF可以改善東莨菪堿引起的空間學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為G組第5天潛伏期和游泳距離較S組短。

G－CSF是一種骨髓干細(xì)胞動(dòng)員劑，可以促進(jìn)干細(xì)胞增殖并通過外周血向受損部位遷移［5］，可以促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成和分泌［6］以及修復(fù)部分受損的神經(jīng)功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果G組ChAT陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)高于S組，說明G－CSF在一定程度上修復(fù)了東莨菪堿造成的中樞膽堿能通路功能的損傷。

綜上所述，東莨菪堿致認(rèn)知障礙的大鼠應(yīng)用G－CSF干預(yù)治療，可以通過上調(diào)ChAT的表達(dá)，修復(fù)受損的膽堿能通路功能，促進(jìn)大鼠學(xué)習(xí)和記憶等功能障礙的恢復(fù)。其改善認(rèn)知功能的其他機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

［1］Ontl T，Xing Y，Bai L，et al.Development and aging of N－methyl－D－aspartate receptor expression in the prefrontal／frontal cortex of mice［J］.Neuroscience，2004，123（2）：467－479.

［2］Shyu WC，Lin SZ，Yang HI，et al.Functional recovery of stroke rats induced by granulocyte colony－stimulating factor－stimulated stem cells［J］.Circulation，2004，110（13）：1847－1854.

［3］Six I，Gasan G，Mura E，et al.Beneficial effect of pharmacological mobilization of bone marrow in experimental cerebral ischemia［J］.European Journal of Pharmacology，2003，458（3）：327－328.

［4］Dubal DB，Kashon ML，Pettigrew LC，et al.Estradiol protects against ischemic injury［J］.Journal of Cerebral Blood Flow＆Metabolism，1998，18（11）：1253－1258.

［5］Yung MC，Hsu CC，Kang CY，et al.A potential for granulocytecolony stimulating factor for use as a prophylactic agent for heatstroke in rats［J］.European Journal of Pharmacology，2011，661（1）：109－117.

［6］Ogawa A，Maeguchi M，Uchida Y，et al.Effect of tazarotene，an acetylenic retinoid，on human dermal fibroblast［J］.Japanese Journal of Pharmacology，1998，76（3）：317－319.