李嬌陽 高彥彬 周盛楠 鄒大威 朱智耀 張娜 崔方強(qiáng) 劉靜

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。在中國近1.14 億的糖尿病患病人群中，2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)約占90.0%，其并發(fā)腎病的患病率為34.7%［1-2］。DN 早期的病理特征表現(xiàn)為腎小球的高濾過、高灌注、高內(nèi)壓，腎小球肥大，繼而導(dǎo)致系膜區(qū)增寬和基底膜增厚，最終發(fā)生腎小球硬化［3］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與DN 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，VEGF 的異常表達(dá)可能是早期腎臟濾過率升高和尿蛋白排泄增加的重要機(jī)制［4］。本研究旨在通過觀察通心絡(luò)對早期DN 大鼠VEGF 表達(dá)的影響，探討通心絡(luò)對腎臟的保護(hù)作用及其部分作用機(jī)制，為通心絡(luò)的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 雄性SD 大鼠40 只，體重180g ～220g，8 周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 高脂飼料 配方為10.0%豬油、20.0%蔗糖、2.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽和67.0%基礎(chǔ)飼料，購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證編號:SCXK(京)2009-0012。

1.1.3 藥品和試劑 通心絡(luò)超微粉(人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香、酸棗仁和冰片等)(批號20121215，河北以嶺藥業(yè));纈沙坦膠囊(批號X1371，北京諾華制藥有限公司)，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(F1030-F0.5，美國Sigma)，大鼠VEGF 酶聯(lián)免疫吸附法測定試劑盒(CSB-E04757r，武漢華美)，VEGF 抗體(ab46154，美國Abcam)，F(xiàn)lt1 抗體(ab32152，美國Abcam)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 CareSens POP 血糖儀(愛科來國際商貿(mào)有限公司)，BioTek EXL800 酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，卓越320、330 全自動生化分析儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)，ELITE200 電泳儀(美國Wealtec)，V-GES 小型垂直電泳槽(美國Wealtec)，PRISM7700 熒光定量 PCR儀(美國ABI)，WD-9413 凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立與分組 40 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)選取10 只為空白組，喂以基礎(chǔ)飼料;其余30 只為造模組，全程喂以高脂飼料。4 周后禁食12 小時，按35 mg/kg 體重一次腹腔注射1%的STZ 溶液(以0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用，pH 4.2 ～4.4，4℃)，空白組注射相當(dāng)劑量的緩沖液。72 小時后經(jīng)大鼠尾尖采血測血糖，以空腹血糖(fasting blood glucoce，F(xiàn)BG)≥16.7 mmol/L 為造模成功。穩(wěn)定5 天后將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、纈沙坦組和通心絡(luò)組。纈沙坦組予纈沙坦膠囊10 mg/(kg·d)灌胃，通心絡(luò)組予通心絡(luò)超微粉0.4 mg/(kg·d)灌胃，空白組及模型組予等量蒸餾水灌胃。治療8 周。

1.2.2 標(biāo)本的收集與處理 8 周后金屬代謝籠收集24 小時尿液;末次給藥后以10%水合氯醛按0.35 mL/100 g 體重麻醉大鼠，腹主動脈取血，部分EDTA 抗凝留取血漿，部分不抗凝留取血清;摘下雙側(cè)腎臟，去包膜，左腎稱重，右腎取皮質(zhì)液氮速凍。尿樣、血液標(biāo)本及腎組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 FBG、UAER、Ccr 及KW/BW 的測定 血糖用血糖儀檢測;尿微量白蛋白采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)= 白蛋白(mg/mL)×總尿量(mL/24h);自動生化分析儀測定血清肌酐(serum reatinine，Scr)、血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和尿肌酐(urea reatinine，Ucr)，內(nèi)生肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)= 尿肌酐× 總尿量(mL/24h)/血肌酐/1440(min)/體重×100;電子天平測定體重(body weight，BW)和腎重(kidney weight，KW)，腎重指數(shù)=KW/BW。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿中VEGF 的表達(dá) 測試時血漿用原液，反應(yīng)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，反應(yīng)終止后5 分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的OD 值，計算樣本濃度。

1.2.5 Western blot 檢測腎組織中VEGF 及Flt1 的蛋白表達(dá) 取腎組織裂解后的上清液檢測總蛋白，每個樣品取相同蛋白含量的粗提液在10% SDSPAGE 膠上電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜;5%脫脂奶粉封閉振蕩1 小時，一抗4℃孵育過夜;5 分鐘×3次洗膜，加入二抗室溫孵育2 小時，TBST 漂洗5 分鐘×3 次;用ECL 試劑暗室內(nèi)膠片曝光，掃描膠片，用圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶。目的蛋白表達(dá)量以目的蛋白/β-actin 的灰度比值表示。

1.2.6 RT-PCR 法檢測腎組織中VEGF 及Flt1 的基因表達(dá) 采用Trigol 試劑提取總RNA，DNase 處理，使用TOYOBO 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 的合成，將內(nèi)參基因(GAPDH)和RT 產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增;1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳后凝膠在紫外燈下觀察拍照，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。以目的基因mRNA 與GAPDH mRNA 吸光度比值表示目的基因mRNA 表達(dá)量。引物信息見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中的引物信息

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠和KW/BW 的水平

如表2所示:與空白組比較，模型組大鼠FBG、UAER、Ccr 和KW/BW 均明顯升高(P ＜0.05);與模型組比較，通心絡(luò)組UAER、Ccr 和KW/BW(P ＜0.05)均明顯降低(P ＜0.05)，F(xiàn)BG 無明顯變化(P＞0.05);通心絡(luò)組與纈沙坦組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示通心絡(luò)單獨(dú)使用無明顯降糖作用，但可以顯著改善腎小球高濾過及腎臟肥大，抑制尿白蛋白的排泄，保護(hù)腎功能。

表2 各組大鼠常規(guī)指標(biāo)的比較(±s，n=10)

表2 各組大鼠常規(guī)指標(biāo)的比較(±s，n=10)

組別FBG(mmol/L)UAER(mg/24h)Ccr(mL/min/BW* 100g)KW/BW(10 -3)5.7 ±0.4 0.42 ±0.06 0.75 ±0.08 3.02 ±0.23模型組 28.0 ±2.5 1.99 ±0.12 1.84 ±0.30 5.87 ±0.47纈沙坦組 27.4 ±3.7 1.51 ±0.19 1.40 ±0.23 4.87 ±0.60空白組通心絡(luò)組26.3 ±2.3 1.37 ±0.17 1.31 ±0.24 4.56 ±0.44

2.2 酶聯(lián)免疫法檢測血漿中VEGF 的表達(dá)

如表3所示:與空白組比較，模型組血漿VEGF含量明顯升高(P ＜0.05);與模型組比較，通心絡(luò)組血漿VEGF 含量明顯降低(P ＜0.05);通心絡(luò)組與纈沙坦組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示通心絡(luò)具有降低DN 大鼠血漿VEGF 表達(dá)的作用。

表3 各組大鼠血漿VEGF 含量的比較(±s，n=10)

表3 各組大鼠血漿VEGF 含量的比較(±s，n=10)

組別 VEGF(pg/ml)6.1 ±2.0模型組 20.0 ±6.9纈沙坦組 11.0 ±3.6空白組通心絡(luò)組10.6 ±2.8

2.3 western blot 及RT-PCR 檢測腎組織中VEGF、Flt1 的表達(dá)

如表4所示:與空白組比較，模型組大鼠腎組織的VEGF 及受體Flt1 的蛋白及基因表達(dá)量均明顯升高(P ＜0.05);與模型組比較，通心絡(luò)組大鼠腎組織的VEGF 及Flt1 的蛋白及基因表達(dá)量明顯降低(P ＜0.05);通心絡(luò)組與纈沙坦組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示通心絡(luò)可以抑制DN 早期大鼠腎組織中VEGF 及受體Flt1 的過度表達(dá)。

表4 各組大鼠腎組織中VEGF 及Flt1 的表達(dá)(±s，n=6)

表4 各組大鼠腎組織中VEGF 及Flt1 的表達(dá)(±s，n=6)

Flt1mRNA組別VEGF 蛋白表達(dá)量Flt1 蛋白表達(dá)量VEGFmRNA表達(dá)量表達(dá)量空白組0.27 ±0.03 1.55 ±0.07 1.36 ±0.24 2.11 ±0.27模型組 0.46 ±0.04 2.06 ±0.10 2.56 ±0.28 3.42 ±0.41纈沙坦組 0.35 ±0.03 1.76 ±0.11 1.86 ±0.11 2.88 ±0.26通心絡(luò)組0.35 ±0.04 1.82 ±0.14 1.70 ±0.19 2.63 ±0.19

3 討論

DN 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，微循環(huán)障礙在DN 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［5］。T2DM 并發(fā)腎病患者早期表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率升高和微量白蛋白尿出現(xiàn)，若得不到重視與治療病情將持續(xù)加重，腎功能呈持續(xù)性減退直至發(fā)展為終末期腎病。VEGF 是一種促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，在腎臟中主要由足細(xì)胞產(chǎn)生。高糖、AngⅡ、缺血和缺氧等多種因素均能刺激VEGFmRNA 表達(dá)與蛋白分泌增加［6］，并通過Flt1(fam 樣酪氨酸激酶受體)信號通路介導(dǎo)DN 早期濾過率的升高和尿蛋白排泄的增加:(1)上調(diào)微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin 的表達(dá)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮VVOs 小孔數(shù)目的增加及窗口的開啟，導(dǎo)致血管壁通透性增加［7］;(2)激活PI3K/Akt 通路，引起足細(xì)胞黏附性降低、脫落增加以及分泌ECM 和Ⅳ型膠原增多，導(dǎo)致血管壁通透性增加［8］;(3)刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌eNOS，增加NO 釋放，引起腎小球入球小動脈相對舒張，導(dǎo)致腎小球囊內(nèi)壓的升高［9］。另外，VEGF 還可以特異性地結(jié)合VEGFR2 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和遷移，引起早期的腎小球肥大，導(dǎo)致濾過率升高和尿蛋白排泄增加［10］。有研究顯示單獨(dú)阻斷AngⅡ1 型受體在抑制AngⅡ作用的同時VEGF 表達(dá)亦顯著減低，因此，抑制VEGF 表達(dá)可能是延緩DN 發(fā)生發(fā)展的途徑之一［11］。

DN 屬于中醫(yī)“消渴”之范疇，高彥彬教授［12］認(rèn)為DN 是糖尿病遷延日久，久病入絡(luò)所致，病位在腎，涉及五臟六腑，病機(jī)以“腎絡(luò)瘀滯”為關(guān)鍵。發(fā)病之初，病在肝腎，氣陰兩虛，腎絡(luò)瘀滯;病程中期，疾病遷延，陰損及陽，脾腎虛衰，腎絡(luò)瘀阻;病變晚期，腎絡(luò)瘀結(jié)，身體勞損，腎用失司，濁毒內(nèi)停，五臟受損，氣血陰陽衰敗而變證峰起。因此，化瘀通絡(luò)是治療DN 的重要治療法則。通心絡(luò)治療冠心病心絞痛療效確切，主要成分包括人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香、酸棗仁、冰片等十二味中藥，全方有益氣通絡(luò)、活血化瘀之效［13］。絡(luò)病是冠心病及糖尿病微血管并發(fā)癥等重大疾病的共性病理基礎(chǔ)［14］，臨床研究證實(shí)通心絡(luò)可有效降低早期DN 患者的尿蛋白排泄率，改善腎功能，聯(lián)合常規(guī)治療能調(diào)節(jié)血糖血脂［15］。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控降解酶系MMP-9/TIMP-1 抑制細(xì)胞外基質(zhì)沉積可能是通心絡(luò)保護(hù)腎臟功能的作用機(jī)制之一［16］。

本研究采用高脂飼料聯(lián)合小劑量STZ 建立動物模型，兩者結(jié)合誘導(dǎo)出更接近人類T2DM 的大鼠模型。T2DM 大鼠呈現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖狀態(tài)，注射STZ1 周后逐漸出現(xiàn)多飲多尿、體型消瘦和精神萎靡等癥狀;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時模型組大鼠UAER、Ccr 和KW/BW 較空白組均明顯升高，符合DN 早期表現(xiàn)。通心絡(luò)治療8 周后UAER、Ccr 和KW/BW 較模型組均顯著減低，證實(shí)通心絡(luò)可以有效改善DN 大鼠早期的高濾過狀態(tài)和腎臟肥大，抑制尿白蛋白的排泄，保護(hù)腎功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)能顯著降低血漿中VEGF 的含量，下調(diào)腎組織中VEGF 及Flt1的基因和蛋白的異常表達(dá)，提示通心絡(luò)對高濾過及蛋白尿的改善作用與抑制VEGF 及其受體Flt1 的表達(dá)有關(guān)。綜上所述，通心絡(luò)可以多途徑、多靶點(diǎn)防治DN的發(fā)生發(fā)展，抑制VEGF 及其受體Flt1 的異常表達(dá)可能是通心絡(luò)保護(hù)腎臟功能的作用機(jī)制之一。

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