孫劍峰 楊 明 陳伯祥★ 賀泂杰 李 杰

(1.甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050)

山羊痘是由山羊痘病毒（Goatpoxvirus,GTPV）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，以發(fā)熱、全身起痘、呼吸道和消化道損傷以及淋巴結(jié)腫大為特征。該病的發(fā)生對養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還會影響到國際貿(mào)易。

近年來，山羊痘疫情在世界各地尤其東亞地區(qū)的暴發(fā)流行態(tài)勢，國內(nèi)貴州、云南等省也有發(fā)病的報(bào)道。山羊痘基因組大小為143—147kb。近年來,大量研究證實(shí)A33R蛋白是痘病毒的一個重要的免疫保護(hù)性抗原,該蛋白可以誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生針對強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)性免疫反應(yīng),其機(jī)制是通過抗體依賴的CTL和ADCC作用殺傷痘病毒胞外包膜病毒粒子(extracellularenvelopedvirion,EEV)以及病毒感染的宿主細(xì)胞,從而阻止EEV在體內(nèi)的擴(kuò)散。基因組學(xué)研究和氨基酸序列比較結(jié)果表明,GTPVORF122編碼產(chǎn)物與痘苗病毒A33R蛋白同源。推測ORF122編碼產(chǎn)物是GTPV的主要免疫保護(hù)性抗原之一,可能在GTPV的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。由于ORF122蛋白是GTPVEEV囊膜上的糖蛋白,而GTPV在細(xì)胞培養(yǎng)物中主要以胞內(nèi)成熟病毒粒子 (intracellularmature virion,IMV)形式存在,ORF122蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)物中含量極少。經(jīng)山羊痘病毒ORF122基因的克隆及免疫原性研究，證實(shí)ORF122蛋白能與GTPV陽性血清反應(yīng)。為此，本研究用表達(dá)了山羊痘病毒ORF122蛋白作免疫抗原，構(gòu)建抗山羊痘病毒ORF122蛋白雜交瘤細(xì)胞，制備單克隆抗體，為進(jìn)一步建立山羊痘的檢測方法奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與菌株

山羊痘毒株(GTPV-S-1)、羊口瘡病毒株、鴿新城疫病毒株、雞減蛋綜合癥病毒株、S.enteritidis和E.coli由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所保存；山羊痘病毒ORF122蛋白抗原由本課題組提供。

1.1.2 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動物

SP2/0細(xì)，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；BALB/C小鼠（18—20g、6—8周齡、雌性），購自衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所小動物室。

1.1.3 主要試劑

新生牛血清（杭州四季青）、DMEM(GIBCO)、HAT、HT、次黃嘌呤（Solarbio）；胸腺嘧啶核苷（Solarbio）；氨基喋呤（Solarbio）；8-氮鳥嘌呤（Solarbio）；羊抗小鼠IGg-HRP（Solarbio）；PEG1500（Merck）；弗氏完全佐劑（Sigma）；弗氏不完全佐劑（Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 抗山羊痘病毒ORF122重組蛋白雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建

1.2.1.1小白鼠免疫

將純化的山羊痘病毒ORF122重組蛋白與弗氏佐劑等比例混合、乳化，分別免疫6-8周齡雌性BALB/C小白鼠6只。首免以弗氏完全佐劑乳化抗原，腹腔注射50μg/只0.2mL)；二免，間隔15d，用弗氏不完全佐劑乳化抗原免疫，腹腔注射50μg/只(0.2mL)；三免，間隔時間15d，不加佐劑的ORF122重組蛋白作為免疫原，背部皮下分6點(diǎn)注射，每只100μg（0.2mL）；同時，從尾部尾靜脈采血，用間接ELISA方法測定免疫小鼠血清的抗體水平。小鼠血清效價(jià)達(dá)到1：4000以上，該小鼠的脾細(xì)胞可作用于細(xì)胞融合。三免后第3d可進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.1.2細(xì)胞融合

免疫小鼠經(jīng)眼眶摘除眼球放血，收集血液，拉頸致死后，用75%酒精浸泡消毒，無菌取小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞，用臺朌蘭染色計(jì)數(shù)，按5：1的比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞（2×107個）混合均勻，1000r/min離心8-10min，去上清，輕彈管底使兩種細(xì)胞混勻。沿管壁緩慢加入1mL50%的PEG1500，邊加邊緩慢均勻轉(zhuǎn)動離心管，在60秒內(nèi)加完。靜置90秒，再加入30mL預(yù)熱的不完全DMEM培養(yǎng)基液終止PEG1500的作用，第1分鐘加完1ml，第2分鐘內(nèi)加完1.5mL，第三分鐘1.5mL，第四分鐘1.5mL，然后再逐漸加快滴加洗液的速度，第五分鐘將不完全DMEM培養(yǎng)基加完。37℃水浴5min后1000r/min離心6min。棄上清，加入含1%HAT的DMEM完全培養(yǎng)基，小心吹散混勻細(xì)胞，在準(zhǔn)備好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上每孔加入0.1mL融合細(xì)胞懸液，最后將融合細(xì)胞培養(yǎng)板放置37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

融合后應(yīng)每日觀察細(xì)胞的生長情況。骨髓瘤細(xì)胞多在融合后2-3d內(nèi)明顯退化，細(xì)胞縮小，核濃縮、破碎。巨噬細(xì)胞增生、肥大，并開始吞噬細(xì)胞碎片。第6d可見克隆狀的雜交廇細(xì)胞生長。此時觀察判斷每孔的細(xì)胞克隆情況，并作好記錄。一般融合后6-7d，每孔移去HAT培養(yǎng)液0.1mL，補(bǔ)加等量的HT培養(yǎng)液。

1.2.1.3篩選和克隆陽性雜交瘤細(xì)胞

待融合后的細(xì)胞生長到覆蓋細(xì)胞孔底部1/4—1/3時，細(xì)胞生長良好時，可用已建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測上清液中的抗體，取樣從含有融合細(xì)胞的孔中吸取0.1mL上清，然后原孔內(nèi)補(bǔ)加等量含1%HT的DMEM完全培養(yǎng)基，同時設(shè)陰、陽性對照，陽性對照孔為免疫小鼠的血清，陰性對照為SP2/0細(xì)胞上清和陰性小鼠血清，檢測為陽性的細(xì)胞孔采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，陰性孔3d后再檢測一次，仍為陰性則棄之。

有限稀釋法進(jìn)行克隆陽性雜交瘤細(xì)胞?？寺∏耙惶旎虍?dāng)天制備飼養(yǎng)細(xì)胞，用1%HT培養(yǎng)液接種到96孔培養(yǎng)板，每孔0.1mL。用含HT的完全培養(yǎng)基將陽性孔中的融合細(xì)胞輕吹打，吸到24孔培養(yǎng)板孔中，取少量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用含1%HT的完全培養(yǎng)基稀釋陽性雜交瘤至20個/mL，l0個/mL，5個/mL。將稀釋好的細(xì)胞懸液分別加到有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，100μL/孔。將培養(yǎng)板置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察生長情況，發(fā)現(xiàn)污染立即用0.1mol/LNaOH消除污染，4d左右確定單克隆細(xì)胞株并半量換液一次培養(yǎng)。待克隆細(xì)胞生長至8—10d時，細(xì)胞長滿孔底大概1/10，檢測上清，標(biāo)出陽性孔。將兩次檢測OD492值高的孔進(jìn)行對照，再取該細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行下一輪的有限稀釋和克隆化培養(yǎng)，如此進(jìn)行3次克隆和亞克隆，直到所有的孔都為陽性。最后選擇OD492值高、細(xì)胞活力好的細(xì)胞孔，轉(zhuǎn)入24孔板，繼而轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，及時凍存。

1.2.2 抗山羊痘病毒ORF122重組蛋白單克隆抗體制備及鑒定

取10周齡BALB/C小鼠，腹腔注射0.5mL滅菌液體石蠟油進(jìn)行預(yù)處理。1周后，將生長良好雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞輕吹下，收集，1000r/min離心10min重懸于不完全DMEM培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)并調(diào)細(xì)胞數(shù)至1.5×106個/mL。每只小鼠腹腔注射0.5mL。待小鼠腹部膨大，用注射器采集腹水，將腹水3000r/min離心20min，收集上清并進(jìn)行抗體效價(jià)的測定，分裝-80℃保存

阻斷試驗(yàn)：用ELISA方法建立阻斷試驗(yàn)來檢測McAb特異性。ORF112蛋白作為抗原包被過夜；用PBST洗3次，加小鼠GTPV陽性血清，同時設(shè)小鼠GTPV陰性血清對照，37℃作用1h；用PBST洗3次，加純化的單克隆抗體（腹水），37℃作用1h；用PBST洗3次，加小鼠酶標(biāo)二抗，37℃作用1h；用PBST洗3次，加顯色劑OPD-H2O2,37℃作用20min，加終止液終止反應(yīng)。在波長492nm測定OD值。判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性血清為陰性，陰性血清為陽性，說明此單抗特異。

特異性檢測：用間接ELISA方法測定單抗分別與山羊痘病毒、羊口瘡病毒、鴿新城疫病毒、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、S.enteritidis和E.coli進(jìn)行交叉反應(yīng)測定。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建

2.1.1 細(xì)胞的融合率

細(xì)胞融合后3～5天觀察，記數(shù)細(xì)胞板中出現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞的孔數(shù)量，除以細(xì)胞培養(yǎng)孔總數(shù)，計(jì)算得到融合率。經(jīng)計(jì)算，GTPV-ORF122蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合率為78.6%。

2.1.2 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選與建立

在細(xì)胞融合后加入1%HATDMEM選擇培養(yǎng)基，使96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中未融合的細(xì)胞（脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞）全部死亡，經(jīng)數(shù)次半量換培養(yǎng)液，致原來脾細(xì)胞分泌的抗體完全消失。當(dāng)融合細(xì)胞集落生長到孔底的1/4～1/3，一般在換液后3～4天或待細(xì)胞培養(yǎng)液發(fā)黃時吸取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清，利用已建立的間接ELISA篩選方法進(jìn)行檢測，選擇OD492nm值高、細(xì)胞狀態(tài)好的雜交瘤細(xì)胞孔進(jìn)行克隆，至少需經(jīng)過3次亞克隆。GTPV-ORF122原核表達(dá)產(chǎn)物免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后，以GTPV-ORF122重組蛋白作為抗原，用建立的間接ELISA方法對篩選的強(qiáng)陽性雜交瘤細(xì)胞孔進(jìn)行3次克隆，獲得6株能穩(wěn)定分泌抗GTPV-ORF122蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名ORF122-1A3、ORF122-2C6、ORF122-2B5、ORF122-2G7、ORF1 22-3E7和ORF122-3F3。

2.2 單克隆抗體及雜交瘤細(xì)胞的鑒定

2.2.1 單克隆抗體的鑒定

2.2.1.1雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水抗體效價(jià)的測定

以GTPV-ORF122重組蛋白為檢測抗原，分別對6株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液及所獲腹水進(jìn)行檢測，同時以SP2/0細(xì)胞上清液和SP2/0細(xì)胞制作的腹水作為陰性對照，間接ELISA檢測上清和腹水抗體效價(jià)，結(jié)果見表1。

表1 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水抗體效價(jià)的測定結(jié)果

2.2.1.2McAb的特異性鑒定

2.2.1.2.1ELISA阻斷試驗(yàn)

GTPV羊的陽性血清阻斷了McAb與GTPV-ORF122蛋白的反應(yīng),底物幾乎不顯色；GTPV羊的陰性血清未阻斷McAb與GTPV-ORF122蛋白的反應(yīng),底物顯色。試驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的McAb具有特異性。

2.2.1.2.2交叉反應(yīng)試驗(yàn)

ELISA檢測結(jié)果表明,McAb只與GTPV反應(yīng),而與Orf、EDS-76、鴿新城疫、S.enteritidis、E.coli均不發(fā)生交叉反應(yīng)。

3 討論

近年來,針對痘苗病毒的大量研究證實(shí),B5R、A33R等EEV囊膜蛋白在痘病毒免疫中發(fā)揮著不可缺少的作用,聯(lián)合接種IMV和EEV蛋白能使免疫動物完全抵御強(qiáng)毒的攻擊[1,2]。由于GTPVORF122編碼產(chǎn)物與痘苗病毒A33R蛋白同源，可能是GTPV的一個重要的免疫保護(hù)性蛋白。李春艷等人研究初期曾試圖原核表達(dá)ORF122全長蛋白,反復(fù)優(yōu)化條件未能表達(dá)出目的蛋白；在明確ORF122基因編碼產(chǎn)物存在跨膜結(jié)構(gòu)域后,截去結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)了該蛋白以截短體的形式高效表達(dá)；還證實(shí)所表達(dá)的融合蛋白能與GTPV陽性血清反應(yīng),表明刪除跨膜域并沒有影響ORF122 蛋白的天然抗原位點(diǎn),其仍具有良好的生物學(xué)活性[3]。本研究所用的山羊痘病毒ORF122蛋白，也是ORF122基因截去跨膜區(qū)實(shí)現(xiàn)了原核表達(dá)所產(chǎn)生的。

本研究構(gòu)建了抗山羊痘病毒ORF122雜交瘤細(xì)胞6株，細(xì)胞上清液抗體效價(jià)達(dá)1：256以上，腹水抗體效價(jià)達(dá)1：104以上。本研究制備的單克隆抗體，可用于山羊痘病毒抗原、抗體檢測提供了良好的生物材料。