郭發(fā)榮, 陳 彬*, 張小卿, 李太山, 綦世金

(1.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 圖書館，貴州 貴陽(yáng) 550025)

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科學(xué)研究

興義矮腳雞GDF5基因外顯子2的克隆及與脛骨長(zhǎng)相關(guān)性研究

郭發(fā)榮1, 陳 彬1*, 張小卿2, 李太山1, 綦世金1

(1.貴州大學(xué) 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 圖書館，貴州 貴陽(yáng) 550025)

為探討GDF5基因外顯子2的SNPs以及與雞脛骨長(zhǎng)的關(guān)聯(lián)性，以興義矮腳雞GDF5基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用基因克隆技術(shù)得到外顯子2序列，直接測(cè)序后檢測(cè)SNPs，并與脛骨長(zhǎng)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，共檢測(cè)到5個(gè)SNPs，前4個(gè)位點(diǎn)(C146A、C296T、G326A和C578G)均為兩種基因型，第5位點(diǎn)(C704T)為三種基因型?；蛐团c脛骨長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析顯示，C578G位點(diǎn)CC基因型個(gè)體脛骨長(zhǎng)顯著高于GC型個(gè)體(P<0.05)，其余SNPs均差異不顯著(P>0.05)。研究表明，GDF5基因可能是影響雞脛骨長(zhǎng)的主效基因或與主效基因相連鎖，C578G位點(diǎn)有望成為脛骨長(zhǎng)性狀選擇的分子遺傳標(biāo)記，為家禽的選育提供理論依據(jù)。

GDF5基因；克??；SNPs；脛骨長(zhǎng)；興義矮腳雞

興義矮腳雞屬蛋肉兼用型雞種，是貴州省獨(dú)具特色的優(yōu)良地方雞種，具有肉質(zhì)細(xì)嫩、體型豐滿等特點(diǎn)。白羽系興義矮腳雞是國(guó)內(nèi)目前為止在地方雞種中發(fā)現(xiàn)并建立起的唯一隱性白羽系[1]。興義矮腳雞因其脛骨短而得名，行走似匍匐前行，不利于品種進(jìn)化。另外，少數(shù)個(gè)體存在腳趾畸形等現(xiàn)象[2]，對(duì)其開發(fā)利用帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。這些遺傳缺陷與影響骨骼發(fā)育的基因相關(guān)，而生長(zhǎng)分化因子5(Growth differentiate factor-5,GDF5)是骨形成蛋白家族中的新成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，促進(jìn)肢體和骨骼發(fā)育等方面具有重要作用。研究表明，GDF5對(duì)雞的骨骼性狀有較大的影響[3]，同時(shí)，能夠促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化[4]，并且以 100 ng/mL的效果最為明顯[5]；除此之外，GDF5的缺失或突變都與骨骼畸形、骨關(guān)節(jié)炎和退變性腰椎間盤等疾病有關(guān)[6-10]，因此有必要對(duì)該品種、基因以及兩者間相關(guān)性進(jìn)行研究。

本研究以GDF5作為影響脛骨生長(zhǎng)的重要候選基因，將檢測(cè)到的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNPs)與脛骨長(zhǎng)進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為尋找家禽骨骼生長(zhǎng)發(fā)育性狀的遺傳標(biāo)記提供參考，同時(shí)為品種的選育和改良奠定基礎(chǔ)，不管從遺傳育種的角度還是開發(fā)利用的角度，都有較大的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取飼養(yǎng)條件相同的5月齡興義矮腳雞白羽系健康母雞42只，測(cè)量個(gè)體脛骨長(zhǎng)等數(shù)據(jù)，每只采集血樣3 mL于肝素鈉抗凝管中后，置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 參考上海生工血液基因組DNA抽提試劑盒(Ezup柱式)步驟提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用NANODROP 2000儀測(cè)定其濃度跟OD值。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI上發(fā)表的原雞GDF5基因序列(GenBank：NC_006107.3)，利用軟件Primer 5設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，委托上海英濰捷基生物公司合成。引物信息見表1。

表1 引物、退火溫度及目的片段信息Table 1 Sequence of primer, annealing temperature and amplified DNA fragment size

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)與條件 PCR體系為10 μL：2×Es Taq Master Mix 5.0 μL，滅菌雙蒸水3.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA(100 ng/μL)模板1 μL。

PCR 條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，65.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃條件保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的純化、連接和轉(zhuǎn)化 參考上海生工PCR產(chǎn)物純化試劑盒(SanPrep柱式)步驟純化PCR產(chǎn)物，將純化產(chǎn)物與PMDTM19-T Vector(大連寶生物) 10 μL體系中16 ℃連接3 h。然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中, 涂布于(配制量1 L)含1 mL 氨芐青霉素(100 mg/mL)、1 mL IPTG(24 mg/mL)和2 mL X-Gal(20 mg/mL)的LB平板中做藍(lán)白斑篩選，37 ℃培養(yǎng)15 h，挑取白色陽(yáng)性菌落，接種于5 mL含0.1 mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 rpm培養(yǎng)12 h，吸取1 μL菌液PCR(條件同上) 鑒定，送陽(yáng)性克隆到上海生工測(cè)序。

1.2.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)與測(cè)序 取5.0 μL PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。利用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理，對(duì)測(cè)序圖譜進(jìn)行分析判定，篩選出SNPs。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)每種基因型頻率和等位基因頻率，用SPSS 18.0軟件對(duì)各基因型與脛骨長(zhǎng)性狀指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示，P1引物擴(kuò)增條帶清晰明亮、整齊單一，擴(kuò)增片段與預(yù)設(shè)目的條帶結(jié)果一致，表明產(chǎn)物濃度高、引物特異性好，可直接用于下一步試驗(yàn)。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖M.DM 5000 DNA Marker；1～4.四種不同個(gè)體PCR產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis patterns of PCR productsM.DM 5000 DNA Marker；1～4. represent PCR products of 4 different individuals

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

GDF5基因外顯子2中共發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNPs(均為同義突變)位點(diǎn)：C146A、C296T、G326A、C578G和C704T。從測(cè)序峰圖(圖2)可見，前4個(gè)位點(diǎn)均只有2種基因型，第5位點(diǎn)有3種基因型，SNPs定位以外顯子2的第一個(gè)堿基A為第一位計(jì)算。

圖2 PCR產(chǎn)物測(cè)序圖Fig. 2 PCR products sequencing

2.3GDF5基因外顯子2的統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 群體遺傳效應(yīng)分析 對(duì)5個(gè)SNPs位點(diǎn)的群體純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量等信息進(jìn)行分析，具體遺傳參數(shù)見表2?？梢奀146A、C296T、G326A和C578G 4個(gè)位點(diǎn)有效等位基因數(shù)都小于2，多態(tài)信息含量表明為低度多態(tài)(PIC<0.25)；而C704T位點(diǎn)有效等位基因數(shù)為2，該等位基因在群體中分布均勻，多態(tài)信息含量表明為中度多態(tài)(0.250.05)。

2.3.2 SNPs與脛骨長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)性分析 關(guān)聯(lián)性分析顯示(表2)：C578G位點(diǎn)CC基因型個(gè)體脛骨長(zhǎng)顯著高于GC型個(gè)體(P<0.05)，其余SNPs均差異不顯著(P>0.05)。

表2 SNPs位點(diǎn)遺傳參數(shù)以及基因型與脛骨長(zhǎng)性狀相關(guān)分析Table 2 Heredity parameter and correlation analysis between genotypes and shin length of SNPs

Notes：Data marked with the different superscripts within the same line indicate significant difference(P<0.05); Low diversity(PIC<0.25), moderate diversity(0.250.5).

3 討 論

隨著對(duì)GDF5進(jìn)一步的研究，人們發(fā)現(xiàn)GDF5能夠增強(qiáng)細(xì)胞的軟骨表達(dá)[11]、成熟和肥大[12]，經(jīng)GDF5轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞可以修復(fù)退變椎間盤[13]，其核心啟動(dòng)子區(qū)+104T>C等位基因可以影響脊柱融合的效果[14]。姚晨等[15]發(fā)現(xiàn)GDF5與肌腱及韌帶的形成有關(guān)，其主要依靠GDF5對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而使脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞分化[16]。同時(shí)，GDF5在神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)、心臟組織修復(fù)等方面都有研究?jī)r(jià)值[17]。除此之外，人們還成功構(gòu)建了GDF5的重組腺病毒載體，為進(jìn)一步研究GDF5基因的潛在功能以及相關(guān)疾病的基因治療奠定了基礎(chǔ)[18]?？梢姡珿DF5基因?qū)趋赖男纬?、生長(zhǎng)和損傷的修復(fù)都有重要的影響，且對(duì)它的研究主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而家禽方面的研究則少有報(bào)道。

本研究以興義矮腳雞白羽系為樣本，克隆GDF5基因外顯子2序列，測(cè)序后共檢測(cè)到5個(gè)SNPs，突變前后其編碼氨基酸并未發(fā)生變化。關(guān)聯(lián)性分析顯示，C578G位點(diǎn)與興義矮腳雞脛骨長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)，具體表現(xiàn)為CC型個(gè)體脛骨長(zhǎng)顯著高于GC型個(gè)體，且符合Hardy-Weinberg平衡定律。3種基因型的群體雜合度最高，表明群體內(nèi)的遺傳變異最大，2種基因型的位點(diǎn)群體雜合度均較低，變異普遍較小，而且2種基因型的有效等位基因數(shù)接近1.2，有可能是因?yàn)榈任换虮旧碓谌后w中分布不均勻或樣本較少導(dǎo)致的，具體原因有待研究。在所有SNPs位點(diǎn)中，只有C704T位點(diǎn)呈現(xiàn)中度多態(tài)，能比較合理地提供遺傳信息，而其余的位點(diǎn)均為低度多態(tài)，這可能是由于樣本序列本身比較保守導(dǎo)致的，更有可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)樣本量較小所致，下一步將擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

研究表明GDF5基因顯著影響興義矮腳雞脛骨長(zhǎng)性狀，該基因可能是控制其脛骨生長(zhǎng)發(fā)育的主效基因或與主效基因相連鎖。同時(shí)，C578G位點(diǎn)可能會(huì)成為脛骨長(zhǎng)性狀選擇的分子遺傳標(biāo)記，在家禽育種和開發(fā)利用工作中以標(biāo)記輔助選擇的方式發(fā)揮作用，為改良家禽脛骨長(zhǎng)性狀奠定一定的基礎(chǔ)。

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GDF5 Gene Excon 2 Cloning and its Relationship with Shin Length of Xingyi Bantam

GUO Fa-rong1, CHEN Bin1*, ZHANG Xiao-qing2,LI Tai-shan1, QI Shi-jin1

(1.CollegeofAnimalSciences;KeyLaboratoryofAnimalGenetics,BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegion,MinistryofEducation;GuizhouKeyLaboratoryofAnimalGenetics,BreedingandReproduction,GuizhouUniversity,GuiyangGuizhou550025,China;2.UnivesityLibrary,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

To analyze the corelation between the SNPs ofGDF5 gene excon 2 and shin length in chicken, Xingyi Bantam were selected to obtain the sequence of excon 2 through gene cloning and detect the SNPs after direct sequencing. The results showed that 5 SNPs were detected in excon 2, the previous 4 SNPs(C146A, C296T, G326A and C578G)were divided into 2 genotypes, the fifth SNP was in 3 genotypes. The study of relationships between genotypes and shin length revealed that shin length of individuals with genotype CC were significantly higher than those with genotype GC in C578G (P<0.05), no significant corelation about other SNPs was found (P>0.05). The result indicated thatGDF5 gene may be a potential major gene or linked major gene which significantly affects shin length in chicken, and C578G a candidate molecular market of MAS, providing theoretical basis for the breeding of poultry.

GDF5 gene; cloning; SNPs; shin length; Xingyi Bantam

2015-01-12

貴州特色優(yōu)質(zhì)雞新品種(系)的培育及綜合配套技術(shù)的研究(2007-3019)

郭發(fā)榮(1985-)，男，甘肅天水人，碩士生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與種質(zhì)資源創(chuàng)新。E-mail：124138512@qq.com

*[通訊作者] 陳 彬(1962-)，男，貴州貴陽(yáng)人，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事分子遺傳與家禽育種研究。E-mail：2436869598@qq.com

S811.6

A

1005-5228(2015)05-0014-04