陳洪波，程 蕾，向 敏，胡修忠，王定發(fā)，劉曉華，凌明湖

(1.武漢輕工大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；2.武漢市農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北 武漢 430208)

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干擾素刺激基因ISG15、OAS1和RSAD2在奶牛早期妊娠診斷中的應(yīng)用

陳洪波1,2，程 蕾2*，向 敏2，胡修忠2，王定發(fā)2，劉曉華2，凌明湖2

(1.武漢輕工大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023；2.武漢市農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北 武漢 430208)

研究旨在探討干擾素刺激基因15(Interferon stimulated gene 15,ISG15)、2′-5′寡腺苷酸合成酶1(2′-5′-oligoadenylate Synthetase 1,OAS1)和S-腺苷甲硫氨酸基區(qū)域蛋白2(Radical S-adenosyl methionine domain containing 2,RSAD2)對(duì)奶牛早期妊娠診斷的價(jià)值，為其在奶牛早期妊娠診斷中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。36頭青年母牛分別于人工授精(artificial insemination, AI)后0 d、18 d、21 d、28 d采集外周血，利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)ISG15、OAS1和RSAD2在18 d外周血總白細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量(相對(duì)于0 d)進(jìn)行了分析；分別利用化學(xué)發(fā)光法和ELISA技術(shù)對(duì)血清孕酮(18 d、21 d)和牛妊娠相關(guān)糖蛋白(pregnancy-associated glycoprotein，PAG),(28 d)進(jìn)行了檢測(cè)。通過建立受試者工作特征曲線(ROC曲線)綜合評(píng)估了三個(gè)候選生物標(biāo)志物單獨(dú)或聯(lián)合檢測(cè)在奶牛早期妊娠診斷中的統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)，并與孕酮檢測(cè)和PAG檢測(cè)的診斷效能進(jìn)行了同步比較分析。對(duì)ISG15、OAS1和RSAD2三者的分析結(jié)果表明，ISG15與RSAD2聯(lián)合檢測(cè)的敏感性和特異性分別為94.7%和100%，具有最優(yōu)的診斷價(jià)值；以血清中孕酮含量作為參考指標(biāo)時(shí)，AI后21 d妊娠診斷的敏感性和特異性與18 d相比較優(yōu)，分別為88.9%和94.1%，但診斷效能不及ISG15、RSAD2二者聯(lián)用；PAG ELISA最早于AI后28 d可做出診斷，且相對(duì)于ISG15-RSAD2聯(lián)用其診斷的特異性較低，為94.12%。綜上所述，利用ISG15和RSAD2基因不僅可望在AI后18 d成功實(shí)現(xiàn)妊娠診斷而且具有最高的靈敏度和特異性，研究結(jié)果為下一步建立奶牛新型早期妊娠診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

奶牛；ISG15；OAS1；RSAD2；ROC曲線；妊娠診斷

繁殖管理是奶牛養(yǎng)殖的必要組成部分，與奶業(yè)生產(chǎn)能力和經(jīng)濟(jì)效益緊密相關(guān)。妊娠診斷是牛群繁殖管理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，實(shí)施早期妊娠診斷可及時(shí)發(fā)現(xiàn)空懷牛并采取有效的繁殖措施，通過誘導(dǎo)發(fā)情和人工授精(artificial insemination, AI)縮短繁殖周期，提高母牛的利用效率。據(jù)報(bào)道，一頭奶牛懷胎每推遲一天，約減奶8～15 kg，最低少生產(chǎn)牛犢0.003頭，飼料、能源、人力等方面的耗費(fèi)約20～30元[1-2]。因此，探索科學(xué)、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)捷的奶牛早期妊娠診斷新技術(shù)顯得尤為重要。

當(dāng)前，直腸觸診是生產(chǎn)中最常用的妊娠診斷方法，技術(shù)成熟的繁殖員于AI后45～50 d可做出準(zhǔn)確診斷，經(jīng)驗(yàn)豐富的人員最早可以在AI后35 d判斷是否妊娠[3-4]。孕酮檢測(cè)法也可以判斷奶牛是否受孕，但是該方法在AI后21～24 d才能準(zhǔn)確判斷[5]。牛奶或者血液中牛妊娠相關(guān)糖蛋白(pregnancy-associated glycoprotein, PAG)水平也能作為奶牛妊娠診斷的依據(jù)，但由于血清中不同PAG水平的差異，只能在妊娠28 d做出較為可靠的判斷[6]。由此可見，這些方法均只能在奶牛人工授精三周后做出準(zhǔn)確診斷。Lucy等[7]研究指出，如果人工授精后一個(gè)情期內(nèi)(三周)能排查出空懷牛，即可對(duì)其進(jìn)行快速的同期發(fā)情處理，在第21～23天進(jìn)行復(fù)配，減少空懷天數(shù)，提高奶牛的繁殖效率。最新的研究報(bào)道也證實(shí)，利用PAG ELISA試劑盒于AI后28 d排查出來的空懷牛，與同樣條件下在妊娠46 d時(shí)利用直腸檢查篩查出的空懷牛相比，對(duì)其實(shí)施同期發(fā)情并再次配種后的妊娠率和空懷天數(shù)并沒有得到改善[8]。這也從一定程度上說明能否于奶牛人工授精后一個(gè)情期內(nèi)排查空懷牛是縮短奶牛產(chǎn)犢間隔和提高繁殖率的關(guān)鍵。

干擾素-τ(IFN-τ)屬于Ι型干擾素的新家族，在AI后14～18 d由孕體合成并分泌，由于其在子宮外的相關(guān)組織以及外周循環(huán)中的含量非常低，限制了IFN-τ在早期妊娠診斷中的直接應(yīng)用。盡管如此，研究表明早期妊娠階段IFN-τ能引起外周血白細(xì)胞中干擾素刺激基因15(Interferon stimulated gene 15，ISG15)、2′-5′寡腺苷酸合成酶1(2′-5′-oligoadenylate Synthetase 1,OAS1)和S-腺苷甲硫氨酸基區(qū)域蛋白2( Radical S-adenosyl methionine domain containing 2，RSAD2)等干擾素刺激基因上調(diào)表達(dá)[9-11]，提示這些干擾素刺激基因可望作為奶牛妊娠診斷的生物標(biāo)志物[10]。雖然利用外周血白細(xì)胞中干擾素刺激基因的表達(dá)量進(jìn)行妊娠診斷為配種后一個(gè)情期內(nèi)排查出空懷牛提供了可能，但是如何利用它們進(jìn)行科學(xué)的妊娠診斷研究方面尚缺乏深入，尤其是相關(guān)判別標(biāo)準(zhǔn)和診斷效能尚不清楚?；诖?，本試驗(yàn)采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了36頭青年母牛AI后18 d外周血白細(xì)胞中ISG15、OAS1和RSAD2基因的相對(duì)表達(dá)量，并且同步檢測(cè)了試驗(yàn)牛群AI后18 d和21 d血清中孕酮以及28 d血清PAG的含量。利用受試者工作特征(ROC)曲線對(duì)這些干擾素刺激基因在奶牛早期妊娠診斷中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)與孕酮檢測(cè)法和利用PAG診斷的效能進(jìn)行了比較，為干擾素刺激基因在妊娠診斷中的應(yīng)用提供客觀、準(zhǔn)確的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣本采集

選擇武漢市某規(guī)?；膛?chǎng)青年牛36頭，分別于AI后0 d、18 d、21 d和28 d經(jīng)尾靜脈采集血液10 mL，其中3 mL經(jīng)EDTAK2自動(dòng)定量靜脈采血管(武漢致遠(yuǎn)醫(yī)療科技有限公司)抗凝，2 h內(nèi)冷藏運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室提取RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆茫黄溆嘌河糜谘宸蛛x，5 000 r/min離心15 min，1.5 mL離心管分裝，-20 ℃保存。AI后50～60 d進(jìn)行直腸檢查，根據(jù)直腸檢查的結(jié)果將試驗(yàn)牛只分為妊娠牛(19頭)和空懷牛(17頭)。

1.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

利用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取血液樣本中總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。利用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific)計(jì)算RNA樣本濃度并進(jìn)行純度分析(OD260/280=1.9～2.1)；利用瓊脂糖凝膠(1.2%)電泳檢測(cè)RNA完整性；通過質(zhì)檢的樣本分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩７崔D(zhuǎn)錄采用RevertAidTMFirst-Strand cDNA Synthesis kit(Fermentas)進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)RNA用量為500 ng，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 牛干擾素刺激基因ISG15、OAS1和RSAD2基因的熒光定量PCR檢測(cè)

用于熒光定量PCR擴(kuò)增的預(yù)混液(SYBR○RGreen Mix)購自東洋紡(上海)生物科技有限公司，反應(yīng)體系共20 μL：2×SYBR○RGreen 10 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA模板0.3 μL，最后用ddH2O補(bǔ)至20 μL。牛ISG15、OAS1和內(nèi)參基因β-Actin引物參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]。RSAD2引物序列根據(jù)NCBI中提供的牛RSAD2基因序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)，具體的引物信息見表1。每個(gè)樣本重復(fù)3次，定量PCR試驗(yàn)在羅氏LightCycler○R480實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性15 s，58～62 ℃退火15 s；72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線及信號(hào)采集：58～95 ℃，0.5 ℃/s，共10 s。

1.4 血清中孕酮和PAG蛋白含量的測(cè)定

孕酮測(cè)定使用北京西門子醫(yī)療診斷設(shè)備有限公司生產(chǎn)的孕酮測(cè)定試劑盒(光化學(xué)發(fā)光法)，嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行操作，孕激素測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0～60 ng/mL。PAG蛋白的檢測(cè)使用北京愛德士元亨生物科技有限公司提供的牛懷孕檢測(cè)試劑盒(PAG ELISA試劑盒)。判斷方法為：血清或EDTA血漿S-N值<0.300，為陰性，表示母?？諔眩谎寤駿DTA血漿S-N值≥0.300，為陽性，表示母牛懷孕。其中，S為A(450nm)-A(參考波長(zhǎng))下測(cè)定樣本的吸光值，N為陰性對(duì)照的平均吸光值。

1.5 目的基因的表達(dá)量分析

基因相對(duì)表達(dá)以2-△△Ct表示樣品中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，0 d時(shí)各基因的相對(duì)表達(dá)量較正為1，18 d時(shí)的表達(dá)量均為0 d時(shí)表達(dá)量的倍數(shù)。

表1 定量PCR引物的序列及參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters used for the real-time quantitative PCR

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。妊娠牛與空懷牛AI后18 dISG15、OAS1和RSAD2基因的相對(duì)表達(dá)量以及AI后18 d和21 d血清中的孕酮含量均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(X ± SEM)”表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；蛳鄬?duì)表達(dá)量的單獨(dú)或聯(lián)合檢測(cè)以及血清中孕酮水平對(duì)早期妊娠診斷效能的評(píng)價(jià)采用受試者工作曲線(ROC)分析，通過繪制ROC曲線圖，計(jì)算各種方法的敏感性和特異性。其中，敏感性代表直腸檢查為妊娠牛的樣品其基因表達(dá)量或孕酮含量檢測(cè)結(jié)果為陽性的比例；特異性代表直腸檢查為空懷牛的樣品其基因表達(dá)量或孕酮含量檢測(cè)結(jié)果為陰性的比例。多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合診斷時(shí)，ROC曲線分析方法參照劉潤(rùn)幸等人的報(bào)道[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 妊娠牛與空懷牛ISG15、OAS1和RSAD2基因的相對(duì)表達(dá)量(AI后18 d)以及孕酮含量(AI后18 d和21 d)檢測(cè)結(jié)果的比較

AI后18 d，妊娠牛外周血白細(xì)胞中ISG15、OAS1和RSAD2基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于空懷牛(P<0.01)，AI后18 d和21 d 妊娠牛血清中孕酮含量均極顯著高于空懷牛(P<0.01)(表2)。

表2 妊娠牛與空懷牛干擾素刺激基因表達(dá)量以及孕酮含量的比較Table 2 Relative expression of the interferon stimulated genes and progesteronelevels between pregnant cows and non-pregnant cows

注：同列肩注不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Notes: Different uppercase superscripts in the same column indicate significant difference(P<0.01).

2.2ISG15、OAS1和RSAD2單個(gè)基因進(jìn)行妊娠診斷時(shí)的效能

根據(jù)ISG15、OAS1和RSAD2單個(gè)基因在AI后18 d的相對(duì)表達(dá)量及妊娠診斷的結(jié)果建立單個(gè)基因用于奶牛早期妊娠診斷的ROC曲線(圖1)。三個(gè)單基因的表達(dá)量進(jìn)行妊娠診斷時(shí)的ROC曲線下面積(AUC)排列順序?yàn)锳UCRSAD2>AUCISG15>AUCOAS1。以Youden指數(shù)最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的臨界值作為判斷妊娠的截?cái)嘀?，即ISG15、OAS1和RSAD2基因的相對(duì)表達(dá)量分別大于或者等于2.190，1.815和1.152時(shí)，對(duì)應(yīng)的敏感性分別為84.2%，84.2%和100%，特異性分別為100%，100%和88.2%(表3)。

圖1 單個(gè)干擾素刺激基因用于妊娠診斷的ROC曲線Fig.1 ROC curves for single interferon stimulated genes in pregnancy diagnosis表3 單個(gè)干擾素刺激基因基于ROC曲線的妊娠診斷性能分析Table 3 Efficiency of single interferon stimulated genes in pregnancy diagnosis based on ROC curves

組別Groups曲線下面積AreasunderROCcurve95%置信區(qū)間95%confidenceinterval臨界值Cutoffpoint敏感性Sensitivity1-特異性1-specificityYouden指數(shù)YoudenindexISG150.9670.920～1.0002.1900.84200.842OAS10.8990.787～1.0001.8150.84200.842RSAD20.9750.934～1.0001.1521.0000.1180.882

2.3ISG15、OAS1和RSAD2多基因聯(lián)合進(jìn)行妊娠診斷的效能

多基因聯(lián)合用于診斷時(shí)，ISG15與RSAD2聯(lián)合應(yīng)用時(shí)ROC曲線面積與ISG15、OAS1和RSAD2三個(gè)基因聯(lián)合應(yīng)用時(shí)相同，且高于其它兩個(gè)組合(圖2)。各組合的最佳臨界值、靈敏性和特異性見表4。從表4知，各組的特異性均達(dá)到100%，但是組合ISG15+RSAD2和ISG15+OAS1+RSAD2的靈敏度最高，均為94.7%，兩個(gè)組合對(duì)應(yīng)的最佳臨界值分別為0.680和0.615。綜合考慮診斷方法的簡(jiǎn)便性，多基因聯(lián)合診斷時(shí)，ISG15聯(lián)合RSAD2的診斷價(jià)值最高。ISG15與RSAD2基因組合應(yīng)用時(shí)，協(xié)變量ISG15和RSAD2的Logistic回歸系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤和P值見表5。從表5可得Logistic回歸方程：P=1/[1+e-(-6.530+2.830X1+0.866X2)](X1=ISG15, X2=RSAD2)，即當(dāng)樣本中ISG15和RSAD2基因的相對(duì)表達(dá)量同時(shí)滿足方程P≥0.680時(shí)，該個(gè)體被診斷為妊娠。

圖2 干擾素刺激基因聯(lián)合用于妊娠診斷的ROC曲線Fig.2 ROC curves for combined interferon stimulated genes in pregnancy diagnosis表4 干擾素刺激基因聯(lián)合基于ROC曲線的妊娠診斷性能分析Table 4 Efficiency of combined interferon stimulated genes in pregnancy diagnosis based on ROC curves

組別Groups曲線下面積AreasunderROCcurve95%置信區(qū)間95%confidenceinterval臨界值Cutoffpoint敏感性Sensitivity1-特異性1-specificityYouden指數(shù)YoudenindexISG15+OAS10.9750.934～1.0000.6510.89500.895ISG15+RSAD20.9910.969～1.0000.6800.94700.947OAS1+RSAD20.9750.936～1.0000.8310.84200.842ISG15+OAS1+RSAD20.9910.969～1.0000.6150.94700.947

表5 協(xié)變量ISG15和RSAD2的Logistic回歸系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤和P值Table 5 Regression coefficient,standard error and P value of the covariates ISG15 and RSAD2 based on the logistic mode

2.4 孕酮進(jìn)行妊娠診斷時(shí)的效能

利用ROC曲線，將AI后18 d和21 d血清中孕酮含量的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，表明以21 d血清中孕酮含量作為妊娠診斷指標(biāo)時(shí)的AUC高于18 d血清中孕酮含量(圖3)。以21 d血清中孕酮含量作為依據(jù)進(jìn)行妊娠診斷時(shí)，AUC大于0.9，提示診斷結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性(表6)；以Youden指數(shù)最大時(shí)的臨界點(diǎn)為最佳的診斷切割點(diǎn)，兩者診斷的特異性相同，但是21 d血清中孕酮含量對(duì)應(yīng)的敏感性高于18 d血清中孕酮含量。因此，以AI后21 d血清中孕酮含量作為指標(biāo)進(jìn)行妊娠診斷的價(jià)值高于18 d血清中孕酮含量。

圖3 孕酮水平(人工授精后18 d和21 d)

用于妊娠診斷的ROC曲線

Fig.3 ROC curves for progesterone levels (18 d and

21 d post AI) in pregnancy diagnosis

2.5 血清中PAG蛋白的檢測(cè)

試驗(yàn)中經(jīng)直腸檢查確認(rèn)，妊娠牛只19頭，空懷牛只17頭。19頭妊娠牛只利用PAG ELISA試劑盒檢測(cè)，其中，18頭奶牛血清樣本的S-N值大于0.300，1頭奶牛血清樣本的S-N值小于0.300。17頭空懷牛只利用PAG ELISA試劑盒檢測(cè)，結(jié)果表明，16頭奶牛血清樣本的S-N值小于0.300，1頭奶牛血清樣本的S-N值大于0.300。因此，在本次試驗(yàn)中，PAG ELISA試劑盒的敏感性為94.74%，特異性為94.12%。

3 討 論

卵子受精之后，胚胎、子宮和卵巢三者在時(shí)空上精密協(xié)調(diào)是妊娠建立的重要保證，期間任何發(fā)育上的不足或異常都有可能導(dǎo)致妊娠失敗。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，牛群的受精率可達(dá)90%，但平均產(chǎn)犢率只有40%～55%，其中約70%～80%的胚胎/胎兒損失發(fā)生在妊娠前三周[13]。研究還指出，大多數(shù)的妊娠失敗主要是由于AI后8～17 d發(fā)生胚胎死亡[14-15]，進(jìn)而在21 d之后返情。本試驗(yàn)中，青年母牛人工授精后18 d，妊娠牛外周血白細(xì)胞中ISG15、OAS1和RSAD2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于空懷牛。研究結(jié)果說明ISG15、OAS1和RSAD2基因在奶牛早期妊娠建立和胚胎發(fā)育的過程中發(fā)揮了重要的作用，同時(shí)也提示人工授精后18 d奶牛血液中ISG15、OAS1和RSAD2基因的表達(dá)量可以作為奶牛早期妊娠診斷的依據(jù)，這為人工授精后一個(gè)情期內(nèi)判別妊娠牛和空懷牛提供了新思路，將有助于生產(chǎn)者盡早發(fā)現(xiàn)空懷牛，進(jìn)而提高奶牛繁殖管理效率。

表6 孕酮水平基于ROC曲線的妊娠診斷性能分析Table 6 Efficiency of the progesterone levels in pregnancy diagnosis based on ROC curves

ROC曲線是一種用于評(píng)價(jià)和比較診斷性試驗(yàn)優(yōu)劣并確定最佳臨界值的理想方法，ROC曲線的AUC可反映診斷試驗(yàn)的準(zhǔn)確性大小，當(dāng)AUC<0.5時(shí)無診斷價(jià)值，AUC在0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，AUC在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，AUC>0.9時(shí)有較高的準(zhǔn)確性。本研究建立了ISG15、OAS1和RSAD2基因的相對(duì)表達(dá)量用于妊娠診斷的ROC曲線，結(jié)果顯示，ISG15和RSAD2基因的表達(dá)量作為妊娠診斷指標(biāo)時(shí)AUC值均在0.9以上，說明具有較高的臨床診斷價(jià)值。研究結(jié)果同時(shí)表明，ISG15和OAS1基因單獨(dú)用于妊娠診斷時(shí)，兩者診斷的敏感性為84.2%，特異性為100%，診斷的效能相同。Han等[5]以AI后18 d外周血液白細(xì)胞中ISG15的表達(dá)量為依據(jù)進(jìn)行早期妊娠診斷，妊娠牛的準(zhǔn)確率為62%，空懷牛的準(zhǔn)確率為89%。而Green等[10]利用OAS1基因于AI后18 d的表達(dá)量對(duì)青年母牛進(jìn)行早期妊娠診斷的準(zhǔn)確性更高，敏感性為82%，特異性為100%；但也指出，以AI后18 d外周血OAS1基因的表達(dá)量與0 d時(shí)的比值大于1.4為臨界點(diǎn)，診斷的敏感度和特異性均為100%。本研究采用的判斷依據(jù)也是青年母牛AI后18 d外周血液OAS1基因的表達(dá)量相對(duì)于0 d的比值，截?cái)嘀禐?.8，與之前的報(bào)道相近，但診斷的敏感性相對(duì)較差，這可能與試驗(yàn)群體、飼養(yǎng)條件以及個(gè)體差異等有關(guān)。另外，RSAD2基因用于妊娠診斷時(shí)，雖然敏感性最高，但特異性僅為88.2%。

ISG15、OAS1和RSAD2基因聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，ISG15與RSAD2基因同時(shí)檢測(cè)的診斷效能與三基因聯(lián)用時(shí)并列最高，優(yōu)于單基因在妊娠診斷中的應(yīng)用。綜合考慮檢測(cè)方法的簡(jiǎn)便性，ISG15與RSAD2基因的聯(lián)用在妊娠診斷中的應(yīng)用價(jià)值最高。Puglies等[16]通過分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，以O(shè)AS1基因在AI后20 d PBMC中的表達(dá)量對(duì)肉牛進(jìn)行妊娠診斷，檢測(cè)方法的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為72.7%、77.2%和75.6%。當(dāng)OAS1與MX2基因聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為66.7%、87.7%和80%，盡管敏感性略微降低，但準(zhǔn)確性和特異性均有不同程度的提高，與本研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)通過ISG15與RSAD2基因的組合應(yīng)用，提高了利用干擾素刺激基因的表達(dá)量對(duì)青年成母牛進(jìn)行早期妊娠的診斷效能，但該方法所使用的依據(jù)是兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(AI后18 d和0 d)干擾素刺激基因表達(dá)量的比值，在一定程度上增加了臨床診斷的復(fù)雜性，使得在實(shí)際中的應(yīng)用略顯復(fù)雜[10]?；谠摲椒ㄔ\斷的敏感性和特異性高，而且能降低由于個(gè)體差異導(dǎo)致誤判的風(fēng)險(xiǎn)，可嘗試大規(guī)模采集青年母牛在人工授精前的樣本作為標(biāo)準(zhǔn)品，人工授精后采集18 d的血樣，比較試驗(yàn)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品中干擾素刺激基因的相對(duì)表達(dá)量判斷奶牛是否懷孕，采用雙重?zé)晒舛縋CR技術(shù)實(shí)現(xiàn)在一次反應(yīng)中同步檢測(cè)外周血白細(xì)胞中ISG15與RSAD2基因的表達(dá)量，最終提供一種簡(jiǎn)便、快速而又準(zhǔn)確的基于定量PCR技術(shù)的奶牛早期妊娠診斷方法。

本研究同步檢測(cè)了試驗(yàn)牛只的孕酮含量，建立了利用AI后18 d和21 d血清中孕酮含量進(jìn)行妊娠診斷的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)以AI后21 d血清中孕酮含量作為參考指標(biāo)時(shí)，診斷的敏感性和特異性相對(duì)較高。由于試驗(yàn)品種差異以及試驗(yàn)檢測(cè)方法不同，依據(jù)孕酮水平判斷奶牛是否早孕的研究報(bào)道中所采用的判斷標(biāo)準(zhǔn)各不相同[5,10,17-18]。本試驗(yàn)中AI后21 d血清中孕酮含量所取的截?cái)嘀禐?.075 ng/mL，若降低截?cái)嘀抵?.5～2.5 ng/mL，診斷的敏感性提高至94.4%，但是特異性降低到64.7%～70.6%，診斷的效能仍然不及ISG15與RSAD2基因的聯(lián)合應(yīng)用。PAG是胎盤功能的標(biāo)志，其進(jìn)入母體的外周血液組織中，因而提供了一種進(jìn)行早期妊娠診斷的方法。李艷艷等[19]用PAG ELISA法對(duì)配種28 d的奶牛進(jìn)行早期妊娠診斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確性與75 d直腸檢查結(jié)果相同，可用于母牛的早期妊娠診斷。本試驗(yàn)利用PAG ELISA試劑盒對(duì)青年母牛進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該方法的敏感性和特異性都能達(dá)到94%以上，與Romano等[20]研究結(jié)果一致。同時(shí)研究結(jié)果也顯示PAG ELISA檢測(cè)與ISG15和RSAD2基因的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)早期妊娠診斷的敏感性相似，但是特異性低于后者?？傊煌焉镌\斷方法的比較結(jié)果提示ISG15和RSAD2基因的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)奶牛早期妊娠的診斷價(jià)值最高，可望用于青年母牛的早期妊娠診斷。另外，由于試驗(yàn)樣品數(shù)量的限制，所得數(shù)據(jù)論據(jù)需要擴(kuò)大群體進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，關(guān)于利用ISG15和RSAD2基因的表達(dá)量對(duì)奶牛個(gè)體進(jìn)行妊娠診斷的方法有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

干擾素刺激基因ISG15、OAS1和RSAD2相對(duì)表達(dá)量的單獨(dú)或聯(lián)合檢測(cè)在奶牛早期妊娠診斷的應(yīng)用中，以ISG15與RSAD2基因聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能最高，其敏感性為94.7%，特異性為100%。與孕酮檢測(cè)法和PAG ELISA試劑盒法的比較分析提示，ISG15和RSAD2的聯(lián)合檢測(cè)具有最高的靈敏度和特異性，可望在人工授精后18 d成功實(shí)現(xiàn)妊娠診斷，本研究結(jié)果同時(shí)也為下一步建立奶牛新型早期妊娠診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

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Application of Interferon Stimulated GenesISG15,OAS1 andRSAD2 in Early Pregnancy Diagnosis of Dairy Cows

CHEN Hong-bo1,2, CHENG Lei2*, XIANG Min2, HU Xiu-zhong2,WANG Ding-fa2, LIU Xiao-hua2, LING Ming-hu2

(1.HubeiCollaborativeInnovationCenterforAnimalNutritionandFeedSafety,SchoolofAnimalScienceandNutritionalEngineering,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan,Hubei430023,China;2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,WuhanAcademyofAgriculturalScience,Wuhan,Hubei430208,China)

To evaluate the diagnostic values of the interferon stimulated genes (ISGs) Interferon Stimulated Gene 15 (ISG15), 2′-5′-oligoadenylate Synthetase 1 (OAS1), and Radical S-adenosyl methionine domain containing 2 (RSAD2) in early pregnancy diagnosis of dairy cows to provide the theoretical foundation for their potential applications in bovine early pregnancy diagnosis, peripheral blood of heifers (n=36) was collected at 0 d, 18 d, 21 d, and 28 d post artificial insemination (AI); Real-time PCR was employed to detect the relative mRNA abundance ofISG15,OAS1 andRSAD2 in the white blood cells (18 d versus 0 d); Levels of serum progesterone (18 d and 21 d) and pregnancy-associated glycoprotein (PAG) (28 d) were detected by using Chemiluminescence Immunoassay and ELISA, respectively. The statistical criteria of the three ISGs, in both single and combined modes, along with the serum progesterone and PAG for bovine early pregnancy diagnosis was assessed and compared by the receiver operating characteristic curve (ROC) analysis. The results showed that the sensitivity and specificity of the combined detection ofISG15 andRSAD2 were 94.7% and 100%, respectively, which had the highest diagnostic value among the three ISGs in single or combined modes. Additionally, the sensitivity and specificity of the serum progesterone levels at 21 d post AI were 88.9% and 94.1%, better than those at 18d post AI, whereas inferior to the combinedISG15 andRSAD2 detection. PAG could only be used in pregnancy diagnosis as early as 28 d post AI and its specificity (94.12%) was lower than combined ofISG15 andRSAD2. In conclusion,ISG15 andRSAD2 could be ideal biomarkers in bovine early pregnancy diagnosis as early as 18 d post AI with the highest sensitivity and specificity.

dairy cow;ISG15;OAS1;RSAD2; ROC curve; pregnancy diagnosis

2014-11-18

2015-01-10

武漢市農(nóng)科院青年英才計(jì)劃項(xiàng)目(YC201201)；武漢市農(nóng)科院人才發(fā)展專項(xiàng)基金(CX201240)；武漢市科技局科技創(chuàng)新平臺(tái)認(rèn)定與計(jì)劃項(xiàng)目(2013020705070350-14)

陳洪波(1981-)，男，山東定陶人，博士，講師，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mail:chen_hong_bo@126.com

*[通訊作者] 程 蕾(1983-)，女，湖北天門人，碩士，畜牧師，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mail:chenglei_011@126.com

S811.6

A

1005-5228(2015)05-0018-07