段國鋒，李麗娟，王爭爭，劉群龍*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 信息學院，山西 太谷 030800；3.山西省生物研究所，山西 太原 030000)

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甜柿SSR擴增反應體系的建立

段國鋒1，李麗娟2，王爭爭3，劉群龍1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 信息學院，山西 太谷 030800；3.山西省生物研究所，山西 太原 030000)

本試驗采用正交試驗設計法，對“陽豐”甜柿SSR-PCR體系中DNA模板濃度、MgCl2濃度、dNTPs濃度、引物、Taq酶用量等進行了優(yōu)化，通過瓊脂糖凝膠電泳對譜帶進行分析，結(jié)果表明體系10為最佳體系:20 μL擴增反應體系中，25 mmol·L-1MgCl2溶液1.4 μL，10 mmol·L-1dNTPs混合液0.4 μL，10 mmol·L-1引物1.1 μL，5 U·μL-1Taq酶液0.4 μL，10 ng·μL-1DNA溶液4.0 μL。所有參試因素中Taq酶對“陽豐”甜柿SSR-PCR擴增結(jié)果影響最大，dNTPs對PCR結(jié)果影響最小。

甜柿；SSR；PCR反應體系

柿(DiospyroskakiThunb.，2n = 6x = 90)，中國為原產(chǎn)地。在我國有2000 年以上的栽培歷史，但我國長期以來主要以澀柿生產(chǎn)為主[1]。柿品種間分類較為復雜，目前就甜柿而言，可主要分為非完全甜柿(non-PCNA)和完全甜柿(PCNA，Pollination-constant and non-astringent)兩類[2～5]。

我國早在1920年就開始從日本引進甜柿品種栽培[6]?！瓣栘S”甜柿，屬于完全甜柿，于1990年在日本育成，親本為：富有×次郎，是產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)良的甜柿品種[7]，由于其具有很高的豐產(chǎn)性和優(yōu)良的品質(zhì)，目前在我國栽培面積逐年增加，但市場上其苗木非?；祀s。

SSR(Simple Sequence Repeats)，微衛(wèi)星DNA或小衛(wèi)星DNA。SSR分子標記具有操作便捷、可靠性高、高重復性等優(yōu)點，近年來，SSR已經(jīng)應用于果樹品種檢測，Thomas[8]，Kijas[9]，Weising[10]利用SSR技術(shù)分別對葡萄、柑橘、獼猴桃等進行了分析研究。Gannavarapur等對桃屬進行了SSR擴增研究，認為大多數(shù)引物能進行有效的SSR擴增，結(jié)果能夠獲得理想的擴增產(chǎn)物[11]。Guilford等利用SSR技術(shù)對蘋果品種進行了多態(tài)性分析，所用引物中有兩條引物可以有效的將供試品種高效區(qū)分開[12]。Kentaro等利用S-RNase基因，并結(jié)合SSR引物對8個供試蘋果品種的親代與子代關系進行了分析，結(jié)果表明SSR能很好的用于蘋果品種的親子代關系分析研究[13]，劉曉麗利用SSR技術(shù)對核桃屬進行了研究，認為中國是世界栽培核桃非常重要的起源中心之一[14]。畢紅園等以玉露香梨為材料進行了SSR分析表明SSR技術(shù)在梨苗木檢測方面有很高的應用價值[15]。本研究以“陽豐”甜柿為材料進行了SSR-PCR反應體系的優(yōu)化，以期為甜柿的苗木鑒定和育種工作提供一定的理論支持。

1 試驗材料與儀器

試驗在山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院果樹學科重點實驗室進行。

1.1 材料

試驗材料采自山西省臨猗縣8年生“陽豐”甜柿樹幼嫩樹葉，液氮冷凍，快速帶回實驗室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器設備、藥品

1.2.1 儀器設備

天平、移液槍、恒溫水浴箱、GG322-TGL-16M臺式高速離心機、EDC-810PCR儀、北京六一DYCZ-30C 型電泳儀等。

1.2.2 藥品

提取液試劑：CTAB、Tris-HCL、NaCl、EDTA、β-巰基乙醇、氯仿-異戊醇(24∶1)。

引物為DKs83：正義引物為GAAGAACAGGGGAGAAGG、反義引物為TGGCAGCAGTAACAGCAT，GenBank收錄號：DC59761。

10×Buffer；氯化鎂(MgCl2)；dNTPs：(dATP、dCTP、dGTP、dTTP等濃度混合液)；Taq酶。

電泳試劑：0.5×TBE(Tris-HCl、EDTA、硼酸)緩沖液；溴化乙錠等。

2 方法

2.1 DNA的提取

提取液配方采用CTAB法，參考文獻[16]并略有改動。

① 將甜柿幼葉片置于液氮環(huán)境中研磨，取適量，轉(zhuǎn)入已預熱的(700 μL)CTAB提取液的1.5 mL離心管中。

② 將離心管置于60℃的水浴鍋中，水浴30 min，期間上下輕輕晃勻數(shù)次。

③ 加入700 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，輕輕混勻5 min，10 000 r·min-1離心15 min。

④ 取上清液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，分別加入500 μL冰冷的無水乙醇，輕輕混勻，用解剖針挑出呈絮狀的DNA轉(zhuǎn)入新的離心管。

⑤ 75%乙醇浸洗兩次每次5 min，去除酒精，將DNA 放置室溫陰干。

⑥ 將DNA加入適量的無菌去離子水溶解，置于-20℃冰箱，備用。

2.2 反應體系的優(yōu)化

采用正交試驗設計，對SSR-PCR體系中的MgCl2、dNTPs、引物、Taq酶、模板DNA等進行優(yōu)化。采用L16(45)正交表，5個因素，每因素4個水平，共16個處理，各處理重復4次，因素水平設置見表1。

表 1 PCR反應體系因素和水平Table 1 The factors and level of PCR reaction system

注：dNTPs濃度為10 mmol·L-1，MgCl2濃度為25 mmol·L-1，引物濃度為10 μmol·L-1,Taq酶液為5 U·μL-1，DNA濃度為10ng·μL-1。表2同。

Note： MgCl2solution is 25 mmol·L-1,dNTPs mixture solution is 10 mmol·L-1,primers solution is 10 mmol·L-1,Taq enzyme solution is 5 U·μL-1,DNA solution is10 ng·μL-1.Table 2 is the same.

采用20 μL反應體系，按表2中的因素水平安排試驗(去離子水補充至20 μL)，并編號，每編號重復4次。反應程序為：94℃預變性4 min，94℃變性35 s，56℃退火35 s，72℃延伸1 min,30循環(huán)，72℃延伸7 min[17]。對反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 正交試驗設計因素水平表Table 2 The factor level of orthogonal test design

3 結(jié)果與分析

由圖1可以看出，各反應體系隨著因素的水平組合不同，PCR擴增的效果也不相同。體系4、15雖有2～3條譜帶，但譜帶模糊不清；體系2、6、7、8、11、12、14基本上沒有譜帶擴增出來；體系1、5、16僅擴增出1條譜帶；體系9、13擴增的譜帶雖然多達3條，但擴增結(jié)果并不理想。體系3和體系10擴增的效果基本一致，二者擴增的譜帶多且豐富，譜帶數(shù)均為13條，均能夠進行分析，但體系10擴增的譜帶相對更為清晰，結(jié)合經(jīng)濟效益分析，體系10是擴增效果最好的體系。該體系為：10 mmol·L-1dNTPs混合液0.4 μL，25 mmol·L-1MgCl2溶液1.4 μL，10 mmol·L-1prime 1.1 μL，5 U·μL-1Taq酶液0.4 μL，10 ng·μL-1DNA溶液1 μL。

圖1 正交體系瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of orthogonal system

結(jié)合圖1、表2和表3可以得出，Taq酶用量對擴增結(jié)果影響較大，20 μL反應體系2 U效果最好。Mg2+濃度對擴增結(jié)果影響起伏較大，對于“陽豐”甜柿SSR-PCR擴增時Mg2+濃度為1.75～2.0 mmol·L-1時，效果擴增效果較好；所有參試因素中Taq酶對“陽豐”甜柿SSR-PCR擴增結(jié)果影響最大，dNTPs對PCR結(jié)果影響最小。

表3 PCR正交實驗設計結(jié)果直觀分析Table 3 Visual analysis of PCR orthogonal design of experiment results

4 討論與結(jié)論

SSR-PCR 反應體系中，Taq酶用量對擴增結(jié)果影響較大，20μL反應體系2 U效果最好。Mg2+通過影響Taq酶對擴增結(jié)果造成影響，濃度過低，出帶不亮，甚至不出帶；濃度過高，非特異性擴增增加。模板DNA濃度過低，會導致擴增條帶模糊，造成結(jié)果不穩(wěn)定；模板DNA濃度過高時容易導致dNTPs 與引物過早消耗完，擴增結(jié)果穩(wěn)定性差。一般來說，Prime濃度過高容易引起堿基錯配率增加，非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生，容易形成二聚體，導致擴增結(jié)果特異性和穩(wěn)定性差。在PCR擴增時，Taq 酶的濃度應該盡量適中，過高不僅會造成試驗成本的增加，而且極易導致非特異性擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生；濃度過低則直接導致產(chǎn)物的合成效率下降[15,18],擴增結(jié)果不穩(wěn)定。本試驗所有參試因素中Taq酶對PCR結(jié)果影響最大，dNTPs對“陽豐”甜柿SSR-PCR擴增結(jié)果影響最小，這與畢紅園[15]，劉曉麗[14]，段國鋒[16]等的結(jié)論一致。

應用單因素試驗優(yōu)化反應體系，需要進行多批次試驗，試驗繁瑣，成本較高[15,19]。采用正交試驗設計，可以減少繁雜試驗規(guī)模，并且能非?？旖莸卣业阶顑?yōu)試驗組合[20]，雖然正交試驗設計是對部分處理進行試驗，但由于它具有以上兩個特征，因此非常適合進行組合優(yōu)化試驗，該試驗運用正交試驗設計可以充分實現(xiàn)對體系的篩選，是非常良好的反應體系優(yōu)化方法。

與其它分子標記技術(shù)相比,SSR標記多態(tài)性更高、帶型更穩(wěn)定，技術(shù)條件要求不高,實驗費用相對較少,而且譜帶更便于識別，因此，SSR標記將是一種高效的甜柿品種鑒定方法。此外，本試驗引入變異系數(shù)對結(jié)果分析，雖然能更科學的說明一些問題，但是其評價依據(jù)數(shù)據(jù)來源過于直觀，會影響結(jié)果的可靠性。

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(編輯:馬榮博)

Establishment of SSR Amplification Reaction System of PCNA

Duan Guofeng1,Li Lijuan2，Wang Zhengzheng3,Liu Qunlong1*

(1.CollegeofHorticulture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China; 2.CollegeofInformation,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China;3.BiologyInstituteofShanxi,TaiyuanShanxi030000，China)

In this experiment using the orthogonal experimental design method,the "Yangfeng" persimmon SSR-PCR system.DNA template concentration,MgCl2concentration,dNTPs concentration,primers,Taq enzyme dosage was optimized,and the results was analysed by agarose gel electrophoresis.The results showed that the 10th system was the best system.The 20 μL amplification reaction system consisted 25 mmol·L-1MgCl2solution 1.4 μL,10 mmol·L-1dNTPs mixture 0.4 μL and 10 mmol·L-1primers 1.1 μL,5 U·μL-1Taq enzyme 0.4 μL and 10 ng·μL-1DNA solution 4.0 μL.All the tested factors,Taq enzyme was the biggest factor of influence on the "Yang Feng" persimmon SSR-PCR,dNTPs with minimal impact on the results of PCR.

PCNA;SSR;PCR reaction system

2015-03-04

2015-04-24

段國鋒(1978-)，男(漢)，山西運城人,講師,博士研究生，研究方向：果樹遺傳育種與采后生理

*通訊作者：劉群龍，副教授，碩士生導師。Tel：13935447606 ；E-mail:lql0288@126.com

國家林業(yè)局948項目(2012-4-67)

S661.2

A

1671-8151(2015)03-0236-05