孫吉鳳 劉劍凱 張淑芳

黃芩素（baicalein，BAI）是從傳統(tǒng)中藥黃芩的根中提取出的一種主要有效成分，它屬于黃酮類化合物[1]。一些以黃芩素作為主要成分的制劑應(yīng)用于抗菌、抗病毒、抗過(guò)敏、抗血栓等多種方面疾病的治療[2-3]。近幾年來(lái)，一些研究表明，黃芩素可以抑制胰腺癌、皮膚癌、宮頸癌細(xì)胞等的增殖，誘導(dǎo)凋亡[4-6]，但具體作用機(jī)制尚待深入研究。喉癌是一種常見的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，具有預(yù)后不良、高死亡率等特點(diǎn)，局部發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者又以預(yù)后不良、高死亡率為特點(diǎn)[7-10]。目前國(guó)內(nèi)外尚未見黃芩素對(duì)喉癌的抑制作用相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)不同濃度黃芩素對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用進(jìn)行研究，從而為進(jìn)一步闡明黃芩素的抗癌機(jī)制及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人喉癌Hep-2細(xì)胞購(gòu)于上海細(xì)胞生物研究所。黃芩素（Baicalein）購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司，用DMSO溶解后配成貯存液置于-20 ℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至所需濃度。胎牛血清、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、臺(tái)盼蘭和吖啶橙（AO）購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于GIBCO/BRL公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 喉癌細(xì)胞株Hep-2于含5%胎牛血清FBS（經(jīng)56 ℃ 30 min滅活），100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，單層細(xì)胞培養(yǎng)；37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)傳代，每次傳代均以0.25%胰蛋白酶消化，洗滌一次，更換新培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hep-2細(xì)胞按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，用5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，更換成無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)液同步化培養(yǎng)24 h，再更換成5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，并加入黃芩素（10、20、40、80 μmol/L），每組藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥物的陰性對(duì)照（加入溶劑DMSO）和不接種細(xì)胞的空白對(duì)照。在CO2孵箱中分別培養(yǎng)24 h及48 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)孵育4 h后，棄上清液，加入150 μL DMSO， 輕輕振蕩10 min，等結(jié)晶物完全溶解后，利用酶標(biāo)儀，在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔A值，按細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-藥物處理組A570值/陰性對(duì)照組A570值）×100%計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率。

1.4 臺(tái)盼蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hep-2細(xì)胞，按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，更換成無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)液同步化培養(yǎng)24 h，最后再更換成5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，并加入終濃度分別為10、20、40、80 μmol/L的黃芩素1 μL，每組藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥物的陰性對(duì)照（加入溶劑DMSO）。細(xì)胞加藥后置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育48 h后，制成單細(xì)胞懸液。再用0.4%的臺(tái)盼蘭染色，染色2~3 min，并在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)拒染的活細(xì)胞。每瓶取5個(gè)視野，數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)該視野內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，求平均值，并計(jì)算細(xì)胞活力=平均活細(xì)胞數(shù)/（平均活細(xì)胞數(shù)+平均死細(xì)胞數(shù)）。

1.5 吖啶橙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用吖啶橙（acridine orange，AO）染色法觀察黃芩素對(duì)Hep-2細(xì)胞形態(tài)的影響。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的Hep-2細(xì)胞，以4×104細(xì)胞數(shù)接種于24孔板中，5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，更換成無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)液同步化培養(yǎng)24 h，最后再更換成5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，并加入終濃度為40 μmol/L及80 μmol/L的黃芩素，每組藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥物的陰性對(duì)照（加入溶劑DMSO）培養(yǎng)48 h后，取出載玻片，PBS洗兩次，滴加0.01%的吖啶橙，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并照相。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（x-±s）表示，重復(fù)測(cè)量的計(jì)量資料采用方差分析，其他用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對(duì)Hep-2 細(xì)胞增殖的影響 圖1為黃芩素（10、20、40、80 μmol/L）作用24、48 h后，對(duì)各組細(xì)胞增殖的影響。其中24 h作用組中，各濃度的抑制率分別為（8.23±0.05）%、（19.48±0.04）%、（53.85±0.07）%、（86.54±0.04）%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；48 h作用組中，各濃度的抑制率分別為（14.52±0.11）%、（34.13±0.06）%、（69.85±0.03）%、（96.43±0.02）%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；說(shuō)明不同濃度的黃芩素作用于腫瘤細(xì)胞，在一定濃度范圍內(nèi)（10~80 μmol/L），隨劑量增加，黃芩素對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的抑制率增加，呈劑量依賴性。同時(shí)48 h作用組與24 h作用組，在不同濃度下的抑制率之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，黃芩素的抑制增殖效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，呈時(shí)間依賴性。

圖1 黃芩素（BAI）對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響

2.2 黃芩素對(duì)Hep-2細(xì)胞活力的影響 陰性對(duì)照組（DMSO）Hep-2細(xì)胞無(wú)藥物刺激，細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，在24、48 h內(nèi)存活率無(wú)明顯變化，均大于98%。表1為終濃度為10、20、40、80 μmol/L的黃芩素作用24、48 h后，臺(tái)盼蘭染色法的各組細(xì)胞計(jì)數(shù)后的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，與陰性對(duì)照組相比，不同濃度的黃芩素作用于Hep-2細(xì)胞，在一定濃度范圍內(nèi)（10~80 μmol/L），以時(shí)間-劑量依賴方式抑制Hep-2 細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 黃芩素（BAI）對(duì)Hep-2細(xì)胞活力的影響（±s，n=5）

表1 黃芩素（BAI）對(duì)Hep-2細(xì)胞活力的影響（±s，n=5）

*與陰性對(duì)照組（加入溶劑DMSO）比較，P<0.05

B A I濃度 2 4 h 4 8 h陰性對(duì)照組（D M S O）9 8.6 5±0.2 3 9 8.0 0±0.0 4 1 0 μ m o l/L 7 8.0 0±0.2 5* 7 6.0 0±0.1 5*2 0 μ m o l/L 6 4.0 0±0.1 2* 5 3.0 0±0.3 1*4 0 μ m o l/L 3 6.0 0±0.1 8* 3 0.0 0±0.1 2*8 0 μ m o l/L 1 6.7 0±0.2 7* 9.4 0±0.1 8*

2.3 黃芩素對(duì)Hep-2細(xì)胞形態(tài)的影響 陰性對(duì)照組（加入溶劑DMSO）和終濃度為40、80 μmol/L的黃芩素作用于Hep-2細(xì)胞48 h后，經(jīng)吖啶橙染色后，在熒光顯微鏡下放大40倍后觀察細(xì)胞形態(tài)見圖2。由圖2可見，陰性對(duì)照組細(xì)胞處于完全貼壁狀態(tài)，并且形態(tài)完整，具有偽足；終濃度為40 μmol/L的黃芩素作用48 h后，細(xì)胞的偽足已收縮，細(xì)胞質(zhì)萎縮，出現(xiàn)凋亡小體；終濃度為80 μmol/L的黃芩素作用48 h后，因更多細(xì)胞壞死使得細(xì)胞相對(duì)更少，細(xì)胞近似卵圓形，細(xì)胞質(zhì)萎縮，有凋亡小體，甚或見黃綠色碎片。

圖2 AO染色法觀察黃芩素對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞形態(tài)的影響（×40）

3 討論

近年來(lái)研究表明，黃芩素作為中藥黃芩的主要活性成分，還具有抗腫瘤作用。黃芩素對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人皮膚癌細(xì)胞等有明顯的增殖抑制作用[11-13]，并與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芩素對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖、細(xì)胞活力及其誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞形態(tài)展開研究。

本研究通過(guò)MTT法表明，終濃度為10、20、40、80 μmol/L的黃芩素，在作用24、48 h后，對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖具有抑制作用，且隨濃度及作用時(shí)間增加，抑制率也增加，最高可達(dá)（96.43±0.02）%。說(shuō)明終濃度為10~80 μmol/L的黃芩素在作用24、48 h后，對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞存在時(shí)間-劑量依賴的增殖抑制作用（P<0.05）。這與王竹君等[14]及張淑群等[15]對(duì)人食管腺癌OE33細(xì)胞及人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的研究結(jié)果相近。臺(tái)盼蘭染色法，是利用臺(tái)盼蘭對(duì)細(xì)胞膜受損的死細(xì)胞進(jìn)行染色來(lái)研究藥物對(duì)細(xì)胞活力影響的一種方法。通過(guò)本研究表明，終濃度為10~80 μmol/L黃芩素作用24 h后，使得Hep-2細(xì)胞活力由陰性對(duì)照組（加入溶劑DMSO）的（98.65±0.23）%降低到（16.70±0.27）%，作用48 h后，使得Hep-2細(xì)胞活力由陰性對(duì)照組（加入溶劑DMSO）（98.00±0.04）%降低到（9.40±0.18）%，說(shuō)明對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞活力的抑制呈時(shí)間-劑量依賴性（P<0.05）。利用堿性熒光染料AO染色法，從形態(tài)學(xué)的角度檢測(cè)到，終濃度為40、80 μmol/L的黃芩素作用48 h后，使得細(xì)胞偽足收縮，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，因細(xì)胞死亡使得貼壁細(xì)胞數(shù)明顯減少。說(shuō)明黃芩素（40、80 μmol/L）作用48 h，可誘導(dǎo)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡。

綜上所述，黃芩素可顯著抑制人喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)是對(duì)黃芩素在腫瘤細(xì)胞抑制作用方面的突破性認(rèn)識(shí)，拓展了對(duì)黃芩素抗癌機(jī)制的研究。黃芩素作為一種藥源充足、安全有效、價(jià)格低廉的中藥成分，相信其在抑制喉癌方面將具有廣闊的應(yīng)用。此外，還需進(jìn)一步對(duì)黃芩素抑制喉癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡等的分子機(jī)制進(jìn)行多方面的深入研究。

[1] Li-Weber M.New therapeutic aspects of flavones：the anticancer properties of scutellaria and its main active constituents wogonin， baicalein and baicalin[J].Cancer Treatment Reviews，2009，35（1）：57-68.

[2] 高燕，顧振綸，蔣小崗，等.黃芩素藥理學(xué)研究新進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（7）：1765-1767.

[3] 關(guān)曉燕，楊潔.黃芩藥理研究概況[J].中醫(yī)藥信息，2006，23（4）：21-23.

[4] Takahashi H，Chen M C，Pham H，et al.Baicalein，a component of Scutellaria baicalensis，induces apoptosis by Mcl-1 down-regulation in human pancreatic cancer cells[J]. Biochim Biophys Acta，2011，1813（8）：1465-1474.

[5] MA G Z，LIU C H，WEI B，et al.Baicalein inhibits DMBA /TPA-induced skin tumorigenesis in mice by modulating proliferation，apoptosis，and inflammation[J]. Inflammation，2012， 546（258）：45-49.

[6] 葉春萍，張慧琳.黃芩素誘導(dǎo)人子宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2012，21（10）：760-763.

[7] Howell G M， Grandis J R.Molecular mediators of metastasis in head and neck squamous cell carcinoma[J].Head Neck，2005， 27（8）：710-717.[8] 姜樹義，王衛(wèi)之，彭又云.分化抑制因子-1與頭頸部腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（4）：150-152.

[9] 吳紅梅.喉癌術(shù)后近期并發(fā)癥的護(hù)理對(duì)策[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（3）：89-90.

[10] 吳雄文，彭增龍，林湘如.喉癌208例手術(shù)治療的臨床療效觀察[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2011，9（16）：13-14.

[11] Huang S T，Wang C Y，Yang R C，et al.Wogonin，an active compound in Scutellaria baicalensis，induces apoptosis and reduces telomerase activity in the HL-60 leukemia cells[J]. Phytomedicine，2010，17（1）：47-54.

[12] Wang C Z，Li X L，Wang Q F，et al.Selective fraction of Scutellaria baicalensis and its chemopreventive effects on MCF-7 human breast cancer cells[J].Phytomedicine， 2010， 17（1）：63-68.

[13] WU B，LI J，HUANG D，et al.Baicalein mediates inhibition of migration and invasiveness of skin carcinoma through Ezrin inA431 cells[J].BMC Cancer，2011，11（2）：527-530.

[14] 王竹君，張強(qiáng)，李丹，等.黃芩素對(duì)人食管腺癌OE33細(xì)胞的抑制作用[J].食品科學(xué)，2011，32（9）：290-294.

[15] 張淑群，高曉燕，薛興歡，等.黃芩素對(duì)人乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞株SATB1表達(dá)的影響[J].中國(guó)腫瘤臨床，2014，41（6）：355-358.