李雁 劉洪濤 李麗 陳春瑩

胎兒生長受限又稱之為宮內(nèi)生長受限，胎兒出生體重明顯低于正常胎兒，是導(dǎo)致圍產(chǎn)兒死亡的主要原因，當(dāng)前有關(guān)胎兒生長受限的研究有不少，一般認(rèn)為與多種因素有關(guān)，胎盤在胎兒的發(fā)育中起到非常重要的作用，為分析胎盤中激活素受體對胎兒生長受限的影響，現(xiàn)分析胎兒生長受限激活素受體表達(dá)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月-2014年8月本院婦產(chǎn)科分娩的產(chǎn)婦31例，依照患者分娩情況分為觀察組16例和對照組15例，觀察組胎兒生長受限，所有胎兒足月體重小于2500 g，Apgar評分大于8分，孕婦年齡（27.68±5.06）歲，BMI（18.37±5.09）kg/m2，產(chǎn)次（1.34±0.35）次；對照組患者分娩正常，足月胎兒出生體重大于2500 g，小于4000 g，Apgar評分大于8分，孕婦年齡（29.34±2.91）歲，BMI（21.63±3.61）kg/m2，產(chǎn)次（1.43±0.53）次。所有標(biāo)本和資料均在獲得患者同意后獲取。兩組患者孕婦均為初產(chǎn)婦，自然受孕，無生殖器官疾病，排除高血壓患者、糖尿病患者、甲狀腺疾病患者、新生兒先天性疾病患者以及遺傳性疾病患者。

1.2 方法

1.2.1 胎盤組織HE染色 在患者胎兒分娩10 min后，剪去母體面胎盤組織，注意避免出血、鈣化區(qū)，采用生理鹽水沖洗干凈后采用福爾馬林液固定，并對兩組患者進(jìn)行標(biāo)記編號。

胎盤組織染色采用蘇木精-伊紅染色法，將組織取材固定2 d后，采用流水反復(fù)清洗，進(jìn)行透明處理、圖蠟，放在EG-1160病例組織包埋機(jī)制成包塊，采用切片機(jī)連續(xù)切片，放在50 ℃溫水中貼片，并表上標(biāo)簽，脫蠟至水，放入蘇木素染液中染色，將切塊放在鹽酸酒精溶液中，切塊變?yōu)闇\紅色，在采用流水清洗，采用伊紅染色，再次經(jīng)過脫水處理，放在二甲苯溶液中浸泡3 min封存，觀察胎盤切塊發(fā)育情況等[1]。

1.2.2 胎盤組織免疫組化染色 在患者胎兒分娩10 min后，剪去母體面胎盤組織，采用生理鹽水沖洗干凈后采用福爾馬林液固定，石蠟切塊與上述一致[2]。將石蠟切片經(jīng)過脫蠟止水，加過氧化氫溶液，消滅細(xì)胞內(nèi)源性過氧化酶的活性，放入PBS中浸泡5 min，自然冷卻，滴加一抗組織液，除去PBS液體，滴加A液50~100 μL，除去PBS液體，再滴加新鮮配制的DAB顯色液50~100 μL，觀察顯色，滿意后采用自來水清晰，采用蘇木素染色，脫水封裝[3]。

1.2.3 胎盤組織Real-Tine PCR檢測 在患者胎兒分娩10 min后，剪去母體面胎盤組織，注意避免出血、鈣化區(qū)，生理鹽水沖洗干凈后，放在-80 ℃水箱中保存[4]。將保存的標(biāo)本取出，放在試管中，加入Trizol試劑1 mL，在冰浴中勻漿，轉(zhuǎn)移到EP試管中，加入氯仿溶液2 mL，置于冰中5 min，離心15 min，取上層液體，加入0.5 mL異丙酮/Trizol液，混合均勻后，靜置、離心，舍棄上清液，加入乙醇混合均勻后再離心，舍棄上清液，加入DEPC水50 μL。在紫外分光光度計(jì)上檢測，OD260/OD280在1.8~2.0范圍內(nèi)為合格。調(diào)整RNA的濃度為0.5 μg/μL。實(shí)時(shí)定量熒光PCR測定中，先在95 ℃下預(yù)變性10 min，然后變性20 s，退火，結(jié)束后做溶解曲線。

1.3 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 胎盤組織免疫組化染色結(jié)果在高倍顯微鏡下觀察切塊，細(xì)胞漿存在褐色顆粒為陽性，沒有著色為0分，著色為淺黃色為1分，著色為棕色為2分，顏色深至深棕色為3分。沒有觀察到陽性細(xì)胞為0分，觀察陽性細(xì)胞小于25%為1分，觀察陽性細(xì)胞在25~50%為2分，觀察陽性細(xì)胞大于50%為3分。實(shí)時(shí)定量熒光PCR測定中闕值定為0.8，相對表達(dá)量采用2-ΔCt[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用字2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤組織HE染色 對照組胎盤組織絨毛發(fā)育良好，主要是合體滋養(yǎng)細(xì)胞，觀察組胎盤組織發(fā)育欠佳，存在較多絨毛內(nèi)間質(zhì)增生。

2.2 免疫組化染色 （1）對照組胎盤組織激活素受體ⅠA染色強(qiáng)度以（-）為主，無陽性染色，觀察組激活素受體ⅠA表達(dá)定位與對照組保持一致。（2）對照組胎盤組織激活素受體主要表現(xiàn)細(xì)胞滋養(yǎng)組織胞漿和合體滋養(yǎng)為主，染色強(qiáng)度主要表現(xiàn)為（-），無陽性表達(dá)，觀察組激活素受體ⅠB與對照組基本一致。（3）對照組激活素受體ⅡA表達(dá)以細(xì)胞滋養(yǎng)組織胞漿和合體滋養(yǎng)，觀察組激活素受體ⅡA表達(dá)定位與對照組表達(dá)一致，染色強(qiáng)度主要是（++~+++）。（4）對照組胎盤組織激活素受體ⅡB主要表達(dá)細(xì)胞滋養(yǎng)組織胞漿和合體滋養(yǎng)，染色強(qiáng)度以（-）為主，觀察組胎盤組織受體ⅡB表達(dá)定位與對照組基本一致，染色強(qiáng)度以（++~+++）為主。

2.3 激活素受體在兩組胎盤組織中的表達(dá) 兩組激活素受體ⅠA、ⅠB表達(dá)差異不明顯（P>0.05），觀察組ⅡA、ⅡB在（++），（+++）的百分比均高于對照組（P<0.05）；觀察組ⅡA、ⅡB在（-）的百分比顯著低于對照組（P<0.05），見表1。

2.4 胎盤組織中激活素受體基因的表達(dá) 觀察組胎盤組織激活素受體ⅠA、ⅠB基因表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），觀察組胎盤組織ⅡA、ⅡB表達(dá)明顯高于對照組（P<0.05），見表2。

表1 激活素受體在兩組胎盤組織中的表達(dá) %

表2 胎盤組織激活素受體基因相對表達(dá)量（x-±s） %

3 討論

胎兒生長受限是對圍生期嚴(yán)重并發(fā)癥之一，圍產(chǎn)兒死亡率非常高，一般認(rèn)為胎兒生長受限后導(dǎo)致血管、胰腺等重要組織器官的永久性改變。當(dāng)前有關(guān)胎兒生長受限的研究有不少，一般認(rèn)為與多種因素有關(guān)，研究胎盤生長受限胎盤激活素受體的表達(dá)有非?，F(xiàn)實(shí)的意義[5-6]。

在本研究中分析胎兒受限胎盤與正常足月胎兒胎盤組織病理，通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，胎兒生長受限胎盤組織發(fā)育不佳，絨毛減少，鈣化增多，結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組患者胎盤成熟與灌注不良有關(guān)。胎盤是母嬰至今物質(zhì)交換的重要器官，對胎兒的發(fā)育起到了重要作用，胎兒的冰壁變化與并發(fā)癥的發(fā)生有很大關(guān)系。有研究指出胎盤主要是由絨毛間質(zhì)、絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞等構(gòu)成，隨著妊娠時(shí)間的不同，胎盤逐漸出現(xiàn)不同的變化，正常足月人本身，絨毛組織主要由合體滋養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)成。胎兒生長受限會(huì)導(dǎo)致胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)變化，胎兒生長受限胎盤組織合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡明顯高于正常胎盤。在本研究中，結(jié)果與以往研究比較類似，推測胎兒生長受限的發(fā)生與胎盤發(fā)育不良有關(guān)[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化方法，分析激活素4種受體的表達(dá)和檢測，結(jié)果表明胎盤組織激活素受體表達(dá)集中在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿和合體滋養(yǎng)細(xì)胞中，也會(huì)在絨毛血管的內(nèi)皮細(xì)胞中少量表達(dá)，這與近幾年的研究比較類似。近幾年很多研究表明妊娠晚期激活素受體主要來自于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，四種激活素受體主要定位于胎盤絨毛血管的內(nèi)皮細(xì)胞，本研究證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。胎兒生長受限胎盤組織中激活素受體ⅡA、ⅡB表達(dá)說明明顯高于對照組，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞陽性染色最強(qiáng)[8]。有研究表明胎兒生長受限與滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡有關(guān)，在本試驗(yàn)中在胎盤組織中定位激活素水平，結(jié)果表明胎盤中細(xì)胞凋亡的定位在絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞層中，與以往研究類似，推測激活素受體可能具有調(diào)節(jié)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡作用，導(dǎo)致胎兒生長受限的發(fā)生[9]。

在本研究中重點(diǎn)分析激活素與胎兒生長受限的關(guān)系。通過免疫組化實(shí)驗(yàn)方法和定量熒光PCR實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合，分別從基因水平和蛋白對激活素水平在胎盤組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明胎兒生長受限胎盤組織激活素受體ⅠA、ⅠB與對照組表達(dá)一致，胎兒生長受限胎盤組織激活素受體ⅡA、ⅡB表達(dá)明顯高于正常足月胎盤（P<0.05），推測激活素受體ⅡA、ⅡB參與胎兒生長受限的發(fā)生[8]。采用不同的研究方法分析激活素受體的表達(dá)，結(jié)果一致，推測胎盤組織中ActRII表達(dá)水平升高會(huì)促使胎兒生長受限[10-12]。在以往的研究中指出激活素A參與到滋養(yǎng)細(xì)胞分化進(jìn)而影響胎兒生長發(fā)育，在研究中可以看出胎兒生長受限胎盤組織中激活素受體ⅡA、ⅡB明顯提高，推測與胎盤變化、血流密切相關(guān)[13-15]。

綜上所述，通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法和免疫組化方法，定位和檢測激活素受體，胎兒生長受限患者胎盤激活素水平明顯要高于正常胎盤，激活素紊亂會(huì)導(dǎo)致胎兒生長受限。在研究中分析胎兒受限胎盤與正常足月胎盤激活素受體表達(dá)，采用免疫組化實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)時(shí)定量熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)合，很好的將蛋白表達(dá)與細(xì)胞定位相結(jié)合，這種實(shí)驗(yàn)方案具有更高的敏感性和特異性，能夠進(jìn)行定位定量檢測，重復(fù)性好。胎兒生長受限的發(fā)病機(jī)制與多因素有關(guān)，在本研究中受到樣本量的限制，僅僅分析妊娠晚期胎盤，還需要分析不同妊娠時(shí)期胎盤激活素的表達(dá)。有研究表明母體血清中激活素A水平能夠預(yù)測胎兒生長受限疾病，在研究激活素受體表達(dá)中并未檢測母體血清和臍血中激活素的表達(dá)，血清和臍血激活素與胎盤中的表達(dá)相關(guān)性沒有準(zhǔn)確的描述，在研究中排除了有合并癥的胎兒生長受限病例，樣本量很少，這方面還需要擴(kuò)大樣本，進(jìn)一步的完善。

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