劉成嬌，夏盟愷，李 楊，王 瑩

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

漾濞泡核桃（Juglans sigillata）別名漾濞核桃、茶核桃、鐵核桃，主要分布于云南、貴州、四川西部、西藏及雅魯藏布江下游等地〔1〕?！吨兴幋筠o典》中記載核桃楸皮和核桃楸果具有清熱、解毒、明目和止痛等功效〔2〕。藥理活性研究表明胡桃楸的不同部位，包括莖枝、皮、根、葉和核桃青皮的提取物均具有抗腫瘤作用〔3-6〕。而對(duì)于核桃成熟果實(shí)內(nèi)皮（核桃殼）的抗腫瘤作用研究較少。云南省大理州漾濞縣為核桃之鄉(xiāng)，大量種植泡核桃。在核桃仁的深加工中，被廢棄的核桃殼大部分被用作農(nóng)戶燃料，造成了資源的極大浪費(fèi)。本研究觀察了泡核桃殼提取組分對(duì)3株腫瘤細(xì)胞的抑制作用，從而為今后泡核桃殼藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 RPMI-1640、新生牛血清、MTT、PBS購(gòu)于Beijing solarbio science&technology co.ltd；順鉑（Cisplatin，DDP）購(gòu)自云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司；青霉素、鏈霉素購(gòu)自河南新鄉(xiāng)華星藥廠；二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽為Amresco公司生產(chǎn)。

1.1.2 細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3、人肝癌細(xì)胞HepG-2、人胃癌細(xì)胞MGC-803均由中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所提供。

1.2 儀器 BB16UV/BB5060UV型CO2培養(yǎng)箱為德國(guó)Heraeus公司生產(chǎn)；IX-7型倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司生產(chǎn)；IX-31型光學(xué)生物顯微鏡為日本Olympus公司生產(chǎn)；連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀為BIOTek公司生產(chǎn)；METFLERAE240型電子分析天平為梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；1.0R型低溫高速離心機(jī)為德國(guó)Heraeus公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 抗腫瘤活性成分的分離提取 泡核桃殼經(jīng)10%NaOH浸泡24 h后，用冰醋酸調(diào)pH為中性，加2、4、6倍乙醇沉淀得到HTKD（D）、HTKE（E）、HTKF（F）提取物，所占生藥百分率分別為7.55%、3.34%和1.32%，精密稱取D、E、F組分，用無(wú)血清培養(yǎng)基RPMI-1640配制成濃度為300μg/mL的原液，0.2μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，再倍比稀釋成150、75、37.5、18.75 μg/mL藥液待用。

2.2 陽(yáng)性對(duì)照藥物的配制 陽(yáng)性藥選用DDP，取1 mg/mL的DDP溶于無(wú)血清的RPMI-1640中，5倍稀釋，終濃度分別為 50、10、2、0.4 μg/mL。

2.3 體外細(xì)胞的培養(yǎng) SKOV-3、HepG-2和MGC-803均用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.4 改良MTT法測(cè)3種不同提取物對(duì)癌細(xì)胞的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞（SKOV-3、HepG-2、MGC-803），將貼壁細(xì)胞濃度調(diào)整為6×104個(gè)/mL，以90μL/孔種入96孔培養(yǎng)板中。同時(shí)設(shè)立空白組、陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組（DDP），每組至少設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，受試組分別加入10μL不同濃度的樣品。加藥后將96孔板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，PBS洗板3次，再加90μL含5%血清RPMI-1640培養(yǎng)液，同時(shí)每孔加10μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加100μL DMSO溶解，570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值（OD）。

2.5 數(shù)據(jù)處理 計(jì)算核桃殼3個(gè)組分在不同測(cè)試濃度下OD值的均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，并用下述公式計(jì)算細(xì)胞的抑制率。細(xì)胞抑制率=（對(duì)照組OD值-給藥組OD值）/對(duì)照組OD值×100%，細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）值由GWBASIC軟件計(jì)算得到。SPSS分析量效相關(guān)系數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 核桃殼提取物對(duì)3株腫瘤細(xì)胞作用24 h時(shí)的半數(shù)抑制濃度 與陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑相比較，核桃殼提取物 D、E、F對(duì)腫瘤細(xì)胞SKOV-3、HepG-2 和MGC-803均有一定的抑制作用，但作用較弱，IC50值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陽(yáng)性藥，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中提取物D對(duì)HepG-2的作用呈雙向性，因而未能求得IC50值。在3個(gè)組分中核桃殼提取物E對(duì)3株腫瘤細(xì)胞的IC50值均最小。見(jiàn)表1。

表1 核桃殼提取物D、E、F對(duì)3株腫瘤細(xì)胞作用24 h時(shí)的IC50（±s）

表1 核桃殼提取物D、E、F對(duì)3株腫瘤細(xì)胞作用24 h時(shí)的IC50（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

提取物DDP HTKD HTKE HTKF MGC-803 1.611±0.207 203.119±42.308**125.175±35.200**175.247±23.196**SKOV-3 4.727±0.675 219.712±32.342**147.520±20.336**427.881±60.465**IC50 HepG-2 1.972±0.295—227.163±32.691**342.622±59.747**

3.2 核桃殼提取物對(duì)3株人癌細(xì)胞作用的量效關(guān)系分析 圖1～3顯示了各組分抑瘤作用的量效關(guān)系。作用24 h后，各組分對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用均呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性（除了組分D對(duì)HepG-2的作用），量效相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2；隨著組分D、E、F濃度的增加，抑制率亦增加。在高濃度（300μg/mL）下，組分E對(duì)3株癌細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于D和F，對(duì)癌細(xì)胞的抑制率超過(guò)60%。見(jiàn)圖1～3。組分D在較低濃度對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2不僅沒(méi)有抑制作用，反而表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，濃度在75μg/mL時(shí)其促生長(zhǎng)作用最明顯。

表2 核桃殼提取物對(duì)3株人癌細(xì)胞作用的量效相關(guān)系數(shù)

圖1 核桃殼提取物D、E和F對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖的抑制作用

圖2 核桃殼提取物D、E和F對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖的抑制作用

圖3 核桃殼提取物D、E和F對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從泡核桃殼中提取得到的3個(gè)組分對(duì)于不同癌細(xì)胞體外增殖均有一定抑制作用，但作用明顯弱于陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑，這可能是由于供試藥品均是天然植物藥的粗提物，有效成分含量較少所致，另外從組分D對(duì)HepG-2的雙向作用來(lái)看，也可能因?yàn)楣┰囁幤分幸种坪痛龠M(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的物質(zhì)混合存在，因而影響了作用效果。其中組分E對(duì)3種癌細(xì)胞體外抑制作用較D和F強(qiáng)。E在高濃度（300 μg/mL）時(shí)，對(duì)3株人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3、肝癌細(xì)胞HepG-2和人胃癌細(xì)胞MGC-803的抑制率分別達(dá)到了61.83%、62.83%和81.47%，組分E的IC50值也均小于D和F，提示主要藥效物質(zhì)可能存在于組分E中。

提取物D對(duì)HepG-2的作用呈雙向性，高濃度（300μg/mL）具有抑制作用，當(dāng)濃度小于150μg/mL時(shí)又表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用，周孟清等〔6〕也發(fā)現(xiàn)，核桃殼提取物小劑量對(duì)小鼠免疫功能有促進(jìn)作用，大劑量作用反而不明顯。這可能是因?yàn)樘烊恢参锼幩幮镔|(zhì)復(fù)雜、存在某些藥效作用相反的成分所致。天然植物藥的研究與開(kāi)發(fā)，在資源、能源危機(jī)已日益突出的今天，具有廣闊的前景和深遠(yuǎn)的意義。本實(shí)驗(yàn)對(duì)泡核桃殼的抗癌作用進(jìn)行初步研究，為其在藥效價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用上奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

〔1〕李寅珊，劉光明，李冬梅.GC-MS法鑒定漾濞泡核桃殼中揮發(fā)性化學(xué)成分〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（25）:1527-1528.

〔2〕江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：下冊(cè)〔M〕.上海：上海人民出版社，1977：1663.

〔3〕文姝，張紅梅，金禮吉，等.胡桃楸提取液誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的研究〔J〕.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2002，14（2）：81-82.

〔4〕季宇彬，汲晨鋒，馬宏圖.青龍衣冷、熱乙醇提取物對(duì)H22小鼠腫瘤細(xì)胞膜生化功能影響的研究〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2005，30（7）：531.

〔5〕周萍，許興景，王敏，等.泡核桃殼棕色素的提取和穩(wěn)定性研究〔J〕.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（7）:3912-3913.

〔6〕周孟清，謝申伍，呂治鋼，等.薄皮核桃殼醌類物質(zhì)微波輔助提取及初步小鼠試驗(yàn)〔J〕.飼料工業(yè)，2013，34（21）:20-23.