李鑫，惠文巧，2，蔣松，賈斌*，張永生，申紅，李洪濤，王緒海，韓國(guó)華，劉帥兵（.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832000；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽合肥230000）

不同MHC-DRB1單倍型哈薩克綿羊感染包蟲病初期小腸組織差異表達(dá)基因篩選與分析

李鑫1，惠文巧1，2，蔣松1，賈斌1*，張永生1，申紅1，李洪濤1，王緒海1，韓國(guó)華1，劉帥兵1
（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832000；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽合肥230000）

前期研究發(fā)現(xiàn)哈薩克綿羊的單倍型MHC-DRB1基因單倍型MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab與細(xì)粒棘球蚴?。òx?。┛剐悦芮邢嚓P(guān)，但具體分子抗病機(jī)制尚不明確。本研究旨在篩選和分析不同MHC基因型哈薩克綿羊感染包蟲病早期小腸組織差異表達(dá)基因。以PCR-RFLP方法根據(jù)MHC-DRB1單倍型選擇抗病和非抗病哈薩克綿羊，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為包蟲病抗性組（A）、包蟲病非抗性組（B）和健康對(duì)照組（C），A、B兩組分別于人工感染包蟲病后2、3、4 h采集小腸組織，以C組為對(duì)照，采用基因芯片的方法分析不同各組間小腸差異表達(dá)基因。結(jié)果表明：A組與C組相比差異表達(dá)的基因共4 712個(gè)，其中表達(dá)量上調(diào)的有1 959個(gè)，表達(dá)量下調(diào)的有2 753個(gè)；B組與C組相比差異表達(dá)的基因4 944個(gè)，其中2 076個(gè)表達(dá)上調(diào)，2 868個(gè)表達(dá)下調(diào)；同C相比，A和B同為上調(diào)或下調(diào)，且表達(dá)量差異顯著的基因有141個(gè)，其中32個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，109個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。綜上，差異基因主要涵蓋了代謝、細(xì)胞進(jìn)程等方面，KEGG分析顯示出現(xiàn)頻率最高的補(bǔ)體凝集素通路代謝途徑值得關(guān)注。

哈薩克羊；包蟲??；小腸；差異基因；生物信息學(xué)分析

棘球蚴?。‥chinocossosis），也稱包蟲病，是由棘球絳蟲的幼蟲-棘球蚴寄生在綿羊等宿主的內(nèi)臟器官發(fā)育為包囊的一種人畜共患?。?］。該疾病呈世界性分布，新疆是包蟲病的主要發(fā)病區(qū)之一［2］，而目前屠宰管理和免疫接種等主要防治方法都有很大局限性。項(xiàng)目組在前期研究中發(fā)現(xiàn)新疆哈薩克綿的單倍型MHC-DRB1：MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab與包蟲病抗性相關(guān)，并證明具有該單倍型的哈薩克綿羊?qū)τ诎x病具有較強(qiáng)的抵抗力，但具體分子作用機(jī)制尚不清楚。細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲-六鉤蚴在感染宿主時(shí)，首先要通過(guò)的第一道物理防線就是小腸黏膜，推測(cè)不同MHC基因型哈薩克綿羊的抗病性差異可能與宿主感染包蟲病后小腸差異表達(dá)基因具有密切相關(guān)性［3］。

近年來(lái)，基因芯片技術(shù)已被應(yīng)用到生物科學(xué)眾多的研究領(lǐng)域之中，例如基因表達(dá)檢測(cè)、突變檢測(cè)、基因組多態(tài)性分析和基因文庫(kù)作圖以及雜交測(cè)序等方面［4-5］，有助于科學(xué)家發(fā)現(xiàn)和了解疾病的感染途徑和宿主的抗病機(jī)制，便于有針對(duì)性地研究開(kāi)發(fā)相應(yīng)診療方法［6-7］。

目前，基因芯片技術(shù)對(duì)分析寄生蟲感染后的宿主基因表達(dá)變化具有很好的應(yīng)用價(jià)值［8］，但在包蟲病方面僅僅圍繞小鼠感染泡球蚴（AE）的動(dòng)物模型上開(kāi)展了相關(guān)研究［9］。因此，采用基因芯片技術(shù)對(duì)哈薩克綿羊人工感染包蟲病后小腸差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，有助于探討宿主對(duì)包蟲病的分子抗病機(jī)制，也可為篩選潛在的分子遺傳育種標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料于新疆兵團(tuán)農(nóng)九師165團(tuán)哈薩克綿羊中心產(chǎn)區(qū)選擇飼養(yǎng)環(huán)境和體重相近的哈薩克綿羊250只帶上耳號(hào)，頸靜脈采血后提取基因組DNA，以RFLP-PCR方法進(jìn)行MHC-DRB1：MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab抗包蟲病單倍型分析；根據(jù)基因分型結(jié)果選擇具有該單倍型的哈薩克綿羊作為實(shí)驗(yàn)組（A組），不具有該單倍型的綿羊作為對(duì)照組（B組）和空白對(duì)照組（C組），經(jīng)ELISA免疫試劑盒和B超確認(rèn)未感染包蟲病，購(gòu)買并飼養(yǎng)于石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，飼養(yǎng)1周后進(jìn)行人工攻蟲試驗(yàn)。

選擇當(dāng)?shù)亟】低寥?qū)蟲后喂食感染包蟲病的綿羊肝臟（含包囊），50 d后宰殺并從犬小腸中分離細(xì)粒棘球蚴含成熟孕節(jié)的絳蟲，同時(shí)人工飼喂A組和B組全部6只綿羊，每只綿羊口服孕卵節(jié)片20個(gè)（前期研究已經(jīng)證明人工感染成功），A、B兩組綿羊于感染蟲卵后2、3、4 h分別屠宰并采集小腸組織，C組綿羊亦屠宰并取其小腸，每組3只綿羊的小腸組織樣本分別標(biāo)記后置于液氮下保存。

1.2 藥品和試劑哈薩克綿羊個(gè)體篩選所用的試劑：綿羊包蟲病ELISA試劑盒購(gòu)自深圳康百得生物科技有限公司；醫(yī)用超聲耦合劑購(gòu)自天津市南開(kāi)區(qū)華科醫(yī)療器械廠；Tris飽和酚、MHC-DRB1 exon2引物及溴酚藍(lán)購(gòu)自上海生工生物工程公司；DNA Marker DL2000、DNA Marker DL500、Taq酶、限制性內(nèi)切酶Mva I、SacII、Hin1I、Hae III等購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；蛋白酶K（Sigma，美國(guó)）、瓊脂糖（Merck，西班牙）；DNA green購(gòu)自北京天恩澤基因有限公司，QIAGEN RNeasy Kit。

1.3 儀器設(shè)備便攜式獸用B超儀（50 S Tringa Vet_Pie Medical，荷蘭）；電子天平BL310（Sartorius公司，德國(guó)）；PCR擴(kuò)增儀（PTC-100TM型，BIO RAD公司）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-4型，北京六一儀器廠）；BIO RAD凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO RAD公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)、Millipore超純水器（密理博中國(guó)有限公司）。

1.4 基因芯片雜交與掃描分析小腸組織樣本分別以Trizol法提取Total RNA，按照說(shuō)明書利用QIAGEN RNeasy Kit純化，合成cDNA后aaUTP標(biāo)記cRNA合成，再次以QIAGEN RNeasy Mini kit純化，經(jīng)過(guò)cRNA濃度測(cè)定和cRNA樣品熒光標(biāo)記后純化，計(jì)算熒光分子濃度及摻入率，進(jìn)行cRNA樣品片段化和芯片雜交、洗滌及芯片掃描和數(shù)據(jù)分析。以Agilent 2100 Bioanalyzer鑒定基因芯片檢出率，用重復(fù)探針點(diǎn)（10次重復(fù)）信號(hào)的CV值來(lái)計(jì)算芯片的穩(wěn)定性和技術(shù)的穩(wěn)定性，根據(jù)不同的芯片，這樣的探針點(diǎn)從20到100個(gè)不等。進(jìn)行差異分析時(shí)，把每?jī)山M間t檢驗(yàn)值P＜0.05的，且差異倍數(shù)大于等于2倍的作為本研究的差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。

該部分工作由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司完成。

1.5 篩選獲得差異基因的熒光定量驗(yàn)證

1.5.1 引物設(shè)計(jì)以持家基因GAPDH為內(nèi)參和目的基因，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），AHSG、ITLN2、MHC、ALB和GAPDH基因序列均來(lái)自NCBI，引物序列由北京華大基因公司合成。

1.5.2 實(shí)時(shí)定量PCR每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)以減少誤差，以陽(yáng)性克隆質(zhì)粒稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)品，將質(zhì)粒10倍梯度稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

反應(yīng)體系為25 μL：質(zhì)粒或cDNA產(chǎn)物1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×SYBR green 11.25 μL，ddH2O 11.75 μL。95℃預(yù)變性4 min；PCR循環(huán)，95℃15 s，退火30 s，72℃1 min，共40個(gè)循環(huán)；然后95℃1 min；退火30 s；95℃30 s。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，用2-△CT相對(duì)定量的方法計(jì)算2個(gè)樣本的相對(duì)表達(dá)量：△CT目的樣品=CT目的樣品－CT內(nèi)參。結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA樣品質(zhì)檢信息RNA的質(zhì)量直接關(guān)系到基因芯片實(shí)驗(yàn)的可靠性和完整性，使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)3個(gè)樣本提取的RNA按照總量，A260/280，28S/18S亮度比值和RIN值等指標(biāo)結(jié)合色譜分析進(jìn)行質(zhì)量判斷，結(jié)果顯示3個(gè)樣本的RNA質(zhì)量均符合實(shí)驗(yàn)要求（表2和圖2）。

2.2 芯片實(shí)驗(yàn)

2.2.1 基因芯片檢出率分析Agilent建議的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)是CV值小于15%，根據(jù)表3結(jié)果，各樣品的芯片CV值均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.2 差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)A組與C組相比，共有差異基因4 712個(gè)，其中1 959個(gè)呈表達(dá)上調(diào)，2 753個(gè)呈表達(dá)下調(diào)；B組與C組相比共有差異基因4 944個(gè)，表達(dá)上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)分別為2 076個(gè)和2 868個(gè)，A組與B組相比差異基因有623個(gè)，其中274個(gè)表達(dá)上調(diào)，349個(gè)表達(dá)下調(diào)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與C組相比，A組和B組在攻蟲后表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)的基因?yàn)? 433個(gè)，其中A組表達(dá)量顯著高于B組的6個(gè)，低于B的有26個(gè)；均下調(diào)的基因?yàn)? 958個(gè)。

圖1 RNA電泳圖

圖2 用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)

表3 熒光標(biāo)記檢測(cè)檢出率

2.2.3 GO富集分析各組間差異表達(dá)的基因go富集結(jié)果比較相似，分子功能分析顯示，大部分差異基因參與了代謝途徑，生化分析顯示外界刺激響應(yīng)通路（reponse to stimulus）和代謝途徑（metabolic process）出現(xiàn)的頻率較高，參與這兩個(gè)途徑的各組間差異基因也較多，以上分析結(jié)果與預(yù)期結(jié)果較為接近。

2.2.4 KEGG代謝通路分析結(jié)果KEGG分析顯示上述對(duì)比方式中各通路激活的模式比較相似，其中補(bǔ)體凝集素途徑出現(xiàn)的基因最多，頻率也最高。

2.3 熒光定量PCR結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3.1 熒光定量溶解曲線檢測(cè)如圖8所示，本研究熒光定量檢測(cè)包括每次對(duì)目的基因和內(nèi)參基因的檢測(cè)，樣本擴(kuò)增時(shí)各輪反應(yīng)均設(shè)置了內(nèi)參，熒光定量PCR結(jié)果均顯示雙峰，說(shuō)明引物特異性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.3.2 熒光定量柱狀圖分析由圖8可知，在3個(gè)組中，ITLN2基因表達(dá)量B組＞A組＞C組（圖8a）；ALB基

表4 部分小腸組織差異表達(dá)基因

圖3 aA組同B組間差異基因的go分子功能分析

圖3 bA組同B組間差異基因go生化進(jìn)程分析

圖3 cA組同B組間差異基因的go細(xì)胞成分分析

圖4 aA組同C組間差異基因go分子功能分析

圖4 bA組同C組間差異基因go生化進(jìn)程分析

圖4 cA組同C組間差異基因go細(xì)胞成分分析

S827.2

：A

：0258-7033（2015）19-0022-07

2014-11-27；

2015-01-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（31260535、31060297）；新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（SKLIB-XJMDR-2012-1）；石河子大學(xué)優(yōu)秀青年項(xiàng)目（2013ZRKXYQ13、2012ZRKXYQ01）

李鑫（1983-），男，在讀博士，講師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail：lixin2032433@qq.com

*通訊作者：賈斌（1965-），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖，E-mail：jiabin@shzu.edu.cn