關(guān)學(xué)敏，耿立英，賀英，李祥龍（河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島066004）

微衛(wèi)星熒光標(biāo)記分析壩上長(zhǎng)尾雞與3個(gè)地方品種雞遺傳多樣性

關(guān)學(xué)敏，耿立英，賀英，李祥龍*
（河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島066004）

為評(píng)估壩上長(zhǎng)尾雞保種群的遺傳結(jié)構(gòu)和其他地方品種雞的遺傳關(guān)系，本研究利用20個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，采用微衛(wèi)星熒光標(biāo)記與毛細(xì)管電泳相結(jié)合的方法，檢測(cè)了4個(gè)地方雞品種共120個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性。結(jié)果表明：20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均為高度多態(tài)，120個(gè)個(gè)體中共檢測(cè)到253個(gè)等位基因，單個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)從4（MCW0103）～27（LEI0094）不等，平均為12.65。所有位點(diǎn)的平均期望雜合度和平均多態(tài)信息含量分別為0.697 5和0.673 6；所有群體均顯示較高的期望雜合度，壩上長(zhǎng)尾雞最高，為0.747 2，太行雞相對(duì)比較低，為0.698 0，平均遺傳分化系數(shù)為0.098，群體內(nèi)的近交系數(shù)為20.4%，雜合子缺失的水平不高；群體的Nei′s遺傳距離從0.059 7（廣西麻雞-太行雞）～0.689 0（北京油雞-太行雞）不等。UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中，廣西麻雞和太行雞聚為一類(lèi)，然后又于壩上長(zhǎng)尾雞聚在一起。北京油雞獨(dú)自聚為一類(lèi)。UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果與這些雞品種的外貌形態(tài)相吻合。

：微衛(wèi)星標(biāo)記；毛細(xì)管電泳；地方雞；遺傳多樣性

壩上長(zhǎng)尾雞是河北省唯一被列入中國(guó)畜禽遺傳資源志［1］的地方家禽品種，因原產(chǎn)于河北省壩上地區(qū)且具尾長(zhǎng)特點(diǎn)而得名。壩上長(zhǎng)尾雞目前分布范圍變窄，數(shù)量急劇減少，作為一個(gè)具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)和蛋品質(zhì)好的優(yōu)良地方品種，然而由于長(zhǎng)期農(nóng)戶(hù)散養(yǎng)及缺乏系統(tǒng)選育，壩上長(zhǎng)尾雞產(chǎn)蛋性能較低。所以，在加強(qiáng)壩上長(zhǎng)尾雞保種同時(shí)，如何合理利用我國(guó)豐富的雞品種資源來(lái)提高壩上長(zhǎng)尾雞的生長(zhǎng)發(fā)育速度、繁殖力并對(duì)其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用已迫在眉睫。但是由于當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶(hù)保種意識(shí)淡薄和外來(lái)品種的侵入雜交，使原來(lái)的地方品種數(shù)量減少，品種純度下降。因此，對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞這一品種遺傳資源的評(píng)估、管理和保護(hù)已成為當(dāng)務(wù)之急。

微衛(wèi)星（SSR）是一種評(píng)估品種遺傳多樣性等研究最有價(jià)值的遺傳標(biāo)記。隨著大量的微衛(wèi)星標(biāo)記在雞的基因組中被發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星標(biāo)記也被廣泛應(yīng)用于雞群體間和群體內(nèi)遺傳關(guān)系的研究［2-6］。SSR這種標(biāo)記雖然操作簡(jiǎn)便，但是使用傳統(tǒng)的銀染法在大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)收集和分析時(shí)存在相當(dāng)大的難度，采用熒光標(biāo)記技術(shù)，利用ABI3 700 DNA分析儀，克服了銀染法的不足，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)收集和處理的自動(dòng)化［7］。

雖然人們利用微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)世界各地家雞的多樣性進(jìn)行研究，對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞這一地方品種資源的前期研究?jī)H局限于該品種資源的分布和狀況的調(diào)查，對(duì)于這一品種遺傳多樣性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記和毛細(xì)管電泳相結(jié)合的技術(shù)對(duì)壩上長(zhǎng)尾雞和其他3個(gè)地方品種共120個(gè)個(gè)體進(jìn)行掃描，對(duì)它們之間的遺傳多樣性和遺傳分化進(jìn)行系統(tǒng)分析，為揭示其遺傳關(guān)系，尤其是為壩上長(zhǎng)尾雞這一地方品種資源的保種工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)所用壩上長(zhǎng)尾雞血樣采自河北蛋雞體系壩上長(zhǎng)尾雞保種群；廣西麻雞血樣采自贊皇縣許亭鄉(xiāng)軍營(yíng)村試驗(yàn)雞場(chǎng)；太行雞血樣采自贊皇縣天然公司太行雞保種核心群；北京油雞血樣采自北京市農(nóng)科院北京油雞保種場(chǎng)，樣本數(shù)均為30只。

1.2 血液基因組DNA的提取雞血液基因組DNA的提取采用北京天根血液基因組提取試劑盒提取。

1.3 微衛(wèi)星引物合成及PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星引物從國(guó)際通用的30對(duì)引物中篩選出20對(duì)引物，分別為ADL0268、MCW0206、LEI0166、MCW0295、MCW0081、MCW0014、MCW0183、ADL0278、MCW0067、MCW0104、MCW0123、MCW0330、MCW0165、MCW0069、MCW0248、MCW0034、MCW0103、LEI0094、MCW0078、ADL0112。所選引物覆蓋所有染色體，表現(xiàn)為多態(tài)性好，特異性強(qiáng)且相互之間并不連鎖。引物5′端用FAM、HEX、TAM 3種熒光標(biāo)記，微衛(wèi)星引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。25 μL反應(yīng)體系：20 ng DNA模板1μL，10pmol/L正向引物，反向引物各0.5μL，10mmol/L dNTP 0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，水17.8 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)，第2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)，72℃修復(fù)延伸6 min。

1.4 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性處理后用美國(guó)ABI公司3730XL測(cè)序列分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，采用Genemapper 4.0軟件和GeneScan－500分子內(nèi)標(biāo)計(jì)算等位基因大小。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析利用Popgene軟件計(jì)算等位基因頻率、觀察雜合度與期望雜合度、F-statistics固定指數(shù)等遺傳指數(shù)；根據(jù)PIC-CALC軟件計(jì)算多態(tài)信息含量；群體間的Nei′s遺傳距離則由FST值算得；利用PHYLIP3.5軟件包，基于Nei′s遺傳距離運(yùn)用UPGMA聚類(lèi)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體內(nèi)的遺傳變異4個(gè)品種雞120個(gè)個(gè)體中共檢測(cè)到253個(gè)等位基因，單個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)從4（MCW0103）～27（LEI0094）不等，平均為12.65。期望雜合度、平均多態(tài)信息含量見(jiàn)表1。對(duì)于整個(gè)群體，所有位點(diǎn)的平均期望雜合度和平均多態(tài)信息含量分別為0.697 5和0.673 6。MCW0103位點(diǎn)的期望雜合度和PIC值最低，為0.462 7和0.242 3；而LEI0094位點(diǎn)的期望雜合度和PIC值是最高的，分別為0.915 3和0.865 4。4個(gè)群體均顯示較高的期望雜合度（表2），壩上長(zhǎng)尾雞最高，為0.747 2，太行雞相對(duì)比較低，為0.698 0。

2.2 群體間的遺傳分化群體間Nei′s遺傳距離從0.059 7（廣西麻雞-太行雞）～0.689 0（北京油雞-太行雞）不等（見(jiàn)表3），廣西麻雞與太行雞的遺傳距離最近，為0.059 7，與北京油雞的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.623 6。

4個(gè)群體20個(gè)位點(diǎn)的遺傳分化分析結(jié)果見(jiàn)表4。整個(gè)群體的平均遺傳分化系數(shù)為0.098，即總的遺傳分化中，約有9.8%源于品種間的差異，90.2%源于品種內(nèi)個(gè)體之間的差異；群體內(nèi)的近交系數(shù)為20.4%，雜合子缺失的水平不高，表明壩上長(zhǎng)尾雞這一地方品種具有高度的遺傳多樣性，有較高的保種潛力，可用于構(gòu)建核心種質(zhì)資源群。

2.3 群體間的聚類(lèi)分析利用Nei′s遺傳距離和UPGMA法對(duì)4個(gè)品種進(jìn)行了聚類(lèi)分析（見(jiàn)圖1）。廣西麻雞和太行雞聚為一類(lèi)，然后又于壩上長(zhǎng)尾雞聚在一起。北京油雞獨(dú)自聚為一類(lèi)。

表1 20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記所在染色體、等位基因數(shù)、等位基因大小、期望雜合度、平均多態(tài)信息含量

表2 4個(gè)群體檢測(cè)到的平均期望雜合度和平均觀察雜合度

表3 4個(gè)群體間Nei′s遺傳距離

3 討論

3.1 樣本量的確定群體遺傳檢測(cè)，檢測(cè)的樣本量越大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性越高，稀有基因被檢出的可能性也越大，而樣本的采集受到多種因素的制約，有時(shí)還會(huì)破壞研究對(duì)象。包文斌等［8］研究結(jié)果表明，當(dāng)樣本量超過(guò)20個(gè)時(shí)，期望雜合度的值趨于穩(wěn)定，才能保證在95%的情況下檢出所有等位基因。本研究所選擇微衛(wèi)星座位的數(shù)目為20個(gè)，實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)每個(gè)群體為30個(gè)，均達(dá)到對(duì)家養(yǎng)動(dòng)物遺傳多樣性檢測(cè)的要求，可以很好地反映壩上長(zhǎng)尾雞保種群遺傳多樣性的現(xiàn)狀。

表4 F-statistics統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

圖1 4個(gè)品種的UPGMA/DA聚類(lèi)

3.2 品種內(nèi)遺傳多樣性分析本研究檢測(cè)的20個(gè)微衛(wèi)星座位中，19個(gè)微衛(wèi)星座位屬于高度多態(tài)座位，只有1個(gè)座位MCW0103屬于低度多態(tài)座位，為0.242 3，而且群體平均多態(tài)信息含量為0.673 6，平均等位基因數(shù)為12.65，平均期望雜合度為0.747 2，顯示出豐富的遺傳多樣性和較高的選擇潛力。這說(shuō)明本研究所選擇的20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)所提供的多態(tài)信息含量豐富，樣本數(shù)量合理，用其分析遺傳多樣性具有較高的有效性和可靠性。

本研究所研究的4個(gè)雞品種中，壩上長(zhǎng)尾雞的遺傳多樣性最高，為0.747 2。太行雞的遺傳多樣性相對(duì)較低，為0.698 0，這與實(shí)際情況是一致的。壩上長(zhǎng)尾雞近年來(lái)才開(kāi)始進(jìn)行系統(tǒng)選育，群體的整齊度較差，而太行雞（河北柴雞）主產(chǎn)于河北省境內(nèi)太行山沿線等地，經(jīng)長(zhǎng)期自然選育而成的蛋肉兼用型地方品種。太行雞養(yǎng)殖已從群眾自發(fā)散養(yǎng)發(fā)展到規(guī)模養(yǎng)殖，初步形成了太行雞規(guī)模化和生態(tài)化養(yǎng)殖［9］，所以群體的整齊度較好。這也說(shuō)明壩上長(zhǎng)尾雞保種群具有豐富的遺傳多樣性和較高的選擇潛力，這與壩上長(zhǎng)尾雞保種群群體PIC整體上為高度多態(tài)性結(jié)果是一致的。同時(shí)也說(shuō)明采用的保種方法效果明顯，有效的保存了群體的遺傳變異。

3.3 品種間的遺傳分化本研究的4個(gè)地方雞品種聚為3類(lèi)。廣西麻雞與太行雞的遺傳距離最近，在聚類(lèi)分析中聚為一起。廣西麻雞的特征可概括為“一麻、兩細(xì)、三短”。一麻是指雞體羽以棕黃麻羽為主；兩細(xì)是指頭細(xì)、脛細(xì)；三短是指頸短、體軀短、脛短［10］；太行雞（河北柴雞）的特征性狀表現(xiàn)為：毛色花各色各異，不是純粹一色，體型好，青腳細(xì)腿，大小適中［11］。這2個(gè)地方品種的羽色、形態(tài)較相近，聚類(lèi)分析中首先聚在一起，然后又與壩上長(zhǎng)尾雞聚在一起，壩上長(zhǎng)尾雞采樣時(shí)也是以麻羽為主［12］；北京油雞的毛色是純色［1］，在聚類(lèi)分析中，獨(dú)自聚為一類(lèi)。UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果與這些雞品種的外貌形態(tài)相吻合，同時(shí)這也說(shuō)明微衛(wèi)星標(biāo)記分析雞品種親緣關(guān)系的可靠性。

4 結(jié)論

本研究檢測(cè)的20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，19個(gè)位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性，各群體均顯示較高的期望雜合度，壩上長(zhǎng)尾雞最高，為0.747 2，太行雞相對(duì)比較低，為0.698 0。整個(gè)群體總的遺傳分化中，約有9.8%源于品種間的差異，90.2%源于品種內(nèi)個(gè)體之間的差異。群體內(nèi)的近交系數(shù)不高，表明壩上長(zhǎng)尾雞這一地方品種具有高度的遺傳多樣性，有較高的保種潛力，可用于構(gòu)建核心種質(zhì)資源群。聚類(lèi)結(jié)果與這些雞品種的羽色等外貌形態(tài)基本吻合。這也說(shuō)明微衛(wèi)星標(biāo)記分析雞品種親緣關(guān)系的可靠性。

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S831.2

：A

：0258-7033（2015）19-0013-04

2014-12-30；

2015-02-07

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)攻關(guān)計(jì)劃（15226302D）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（QN2015023）

關(guān)學(xué)敏（1977-），女，山西河曲人，副教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，E-mail：guanxueming109@163.com

*通訊作者：李祥龍（1963-），男，河北豐南人，博導(dǎo)，教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種，E-mail：lixianglongcn@yahoo.com