關(guān)學(xué)敏，耿立英，賀英，李祥龍（河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島066004）

微衛(wèi)星熒光標(biāo)記分析壩上長尾雞與3個(gè)地方品種雞遺傳多樣性

關(guān)學(xué)敏，耿立英，賀英，李祥龍*
（河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島066004）

為評估壩上長尾雞保種群的遺傳結(jié)構(gòu)和其他地方品種雞的遺傳關(guān)系，本研究利用20個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，采用微衛(wèi)星熒光標(biāo)記與毛細(xì)管電泳相結(jié)合的方法，檢測了4個(gè)地方雞品種共120個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性。結(jié)果表明：20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均為高度多態(tài)，120個(gè)個(gè)體中共檢測到253個(gè)等位基因，單個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)從4（MCW0103）～27（LEI0094）不等，平均為12.65。所有位點(diǎn)的平均期望雜合度和平均多態(tài)信息含量分別為0.697 5和0.673 6；所有群體均顯示較高的期望雜合度，壩上長尾雞最高，為0.747 2，太行雞相對比較低，為0.698 0，平均遺傳分化系數(shù)為0.098，群體內(nèi)的近交系數(shù)為20.4%，雜合子缺失的水平不高；群體的Nei′s遺傳距離從0.059 7（廣西麻雞-太行雞）～0.689 0（北京油雞-太行雞）不等。UPGMA系統(tǒng)發(fā)生樹中，廣西麻雞和太行雞聚為一類，然后又于壩上長尾雞聚在一起。北京油雞獨(dú)自聚為一類。UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果與這些雞品種的外貌形態(tài)相吻合。

：微衛(wèi)星標(biāo)記；毛細(xì)管電泳；地方雞；遺傳多樣性

壩上長尾雞是河北省唯一被列入中國畜禽遺傳資源志［1］的地方家禽品種，因原產(chǎn)于河北省壩上地區(qū)且具尾長特點(diǎn)而得名。壩上長尾雞目前分布范圍變窄，數(shù)量急劇減少，作為一個(gè)具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)和蛋品質(zhì)好的優(yōu)良地方品種，然而由于長期農(nóng)戶散養(yǎng)及缺乏系統(tǒng)選育，壩上長尾雞產(chǎn)蛋性能較低。所以，在加強(qiáng)壩上長尾雞保種同時(shí)，如何合理利用我國豐富的雞品種資源來提高壩上長尾雞的生長發(fā)育速度、繁殖力并對其進(jìn)一步開發(fā)利用已迫在眉睫。但是由于當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶保種意識淡薄和外來品種的侵入雜交，使原來的地方品種數(shù)量減少，品種純度下降。因此，對壩上長尾雞這一品種遺傳資源的評估、管理和保護(hù)已成為當(dāng)務(wù)之急。

微衛(wèi)星（SSR）是一種評估品種遺傳多樣性等研究最有價(jià)值的遺傳標(biāo)記。隨著大量的微衛(wèi)星標(biāo)記在雞的基因組中被發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星標(biāo)記也被廣泛應(yīng)用于雞群體間和群體內(nèi)遺傳關(guān)系的研究［2-6］。SSR這種標(biāo)記雖然操作簡便，但是使用傳統(tǒng)的銀染法在大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)收集和分析時(shí)存在相當(dāng)大的難度，采用熒光標(biāo)記技術(shù)，利用ABI3 700 DNA分析儀，克服了銀染法的不足，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)收集和處理的自動化［7］。

雖然人們利用微衛(wèi)星位點(diǎn)對世界各地家雞的多樣性進(jìn)行研究，對壩上長尾雞這一地方品種資源的前期研究僅局限于該品種資源的分布和狀況的調(diào)查，對于這一品種遺傳多樣性的研究尚未見報(bào)道。本研究利用微衛(wèi)星標(biāo)記和毛細(xì)管電泳相結(jié)合的技術(shù)對壩上長尾雞和其他3個(gè)地方品種共120個(gè)個(gè)體進(jìn)行掃描，對它們之間的遺傳多樣性和遺傳分化進(jìn)行系統(tǒng)分析，為揭示其遺傳關(guān)系，尤其是為壩上長尾雞這一地方品種資源的保種工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)所用壩上長尾雞血樣采自河北蛋雞體系壩上長尾雞保種群；廣西麻雞血樣采自贊皇縣許亭鄉(xiāng)軍營村試驗(yàn)雞場；太行雞血樣采自贊皇縣天然公司太行雞保種核心群；北京油雞血樣采自北京市農(nóng)科院北京油雞保種場，樣本數(shù)均為30只。

1.2 血液基因組DNA的提取雞血液基因組DNA的提取采用北京天根血液基因組提取試劑盒提取。

1.3 微衛(wèi)星引物合成及PCR擴(kuò)增微衛(wèi)星引物從國際通用的30對引物中篩選出20對引物，分別為ADL0268、MCW0206、LEI0166、MCW0295、MCW0081、MCW0014、MCW0183、ADL0278、MCW0067、MCW0104、MCW0123、MCW0330、MCW0165、MCW0069、MCW0248、MCW0034、MCW0103、LEI0094、MCW0078、ADL0112。所選引物覆蓋所有染色體，表現(xiàn)為多態(tài)性好，特異性強(qiáng)且相互之間并不連鎖。引物5′端用FAM、HEX、TAM 3種熒光標(biāo)記，微衛(wèi)星引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。25 μL反應(yīng)體系：20 ng DNA模板1μL，10pmol/L正向引物，反向引物各0.5μL，10mmol/L dNTP 0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，水17.8 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個(gè)循環(huán)，第2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)，72℃修復(fù)延伸6 min。

1.4 PCR產(chǎn)物的檢測第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性處理后用美國ABI公司3730XL測序列分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，采用Genemapper 4.0軟件和GeneScan－500分子內(nèi)標(biāo)計(jì)算等位基因大小。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析利用Popgene軟件計(jì)算等位基因頻率、觀察雜合度與期望雜合度、F-statistics固定指數(shù)等遺傳指數(shù)；根據(jù)PIC-CALC軟件計(jì)算多態(tài)信息含量；群體間的Nei′s遺傳距離則由FST值算得；利用PHYLIP3.5軟件包，基于Nei′s遺傳距離運(yùn)用UPGMA聚類法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體內(nèi)的遺傳變異4個(gè)品種雞120個(gè)個(gè)體中共檢測到253個(gè)等位基因，單個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)從4（MCW0103）～27（LEI0094）不等，平均為12.65。期望雜合度、平均多態(tài)信息含量見表1。對于整個(gè)群體，所有位點(diǎn)的平均期望雜合度和平均多態(tài)信息含量分別為0.697 5和0.673 6。MCW0103位點(diǎn)的期望雜合度和PIC值最低，為0.462 7和0.242 3；而LEI0094位點(diǎn)的期望雜合度和PIC值是最高的，分別為0.915 3和0.865 4。4個(gè)群體均顯示較高的期望雜合度（表2），壩上長尾雞最高，為0.747 2，太行雞相對比較低，為0.698 0。

2.2 群體間的遺傳分化群體間Nei′s遺傳距離從0.059 7（廣西麻雞-太行雞）～0.689 0（北京油雞-太行雞）不等（見表3），廣西麻雞與太行雞的遺傳距離最近，為0.059 7，與北京油雞的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.623 6。

4個(gè)群體20個(gè)位點(diǎn)的遺傳分化分析結(jié)果見表4。整個(gè)群體的平均遺傳分化系數(shù)為0.098，即總的遺傳分化中，約有9.8%源于品種間的差異，90.2%源于品種內(nèi)個(gè)體之間的差異；群體內(nèi)的近交系數(shù)為20.4%，雜合子缺失的水平不高，表明壩上長尾雞這一地方品種具有高度的遺傳多樣性，有較高的保種潛力，可用于構(gòu)建核心種質(zhì)資源群。

2.3 群體間的聚類分析利用Nei′s遺傳距離和UPGMA法對4個(gè)品種進(jìn)行了聚類分析（見圖1）。廣西麻雞和太行雞聚為一類，然后又于壩上長尾雞聚在一起。北京油雞獨(dú)自聚為一類。

表1 20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記所在染色體、等位基因數(shù)、等位基因大小、期望雜合度、平均多態(tài)信息含量

表2 4個(gè)群體檢測到的平均期望雜合度和平均觀察雜合度

表3 4個(gè)群體間Nei′s遺傳距離

3 討論

3.1 樣本量的確定群體遺傳檢測，檢測的樣本量越大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性越高，稀有基因被檢出的可能性也越大，而樣本的采集受到多種因素的制約，有時(shí)還會破壞研究對象。包文斌等［8］研究結(jié)果表明，當(dāng)樣本量超過20個(gè)時(shí)，期望雜合度的值趨于穩(wěn)定，才能保證在95%的情況下檢出所有等位基因。本研究所選擇微衛(wèi)星座位的數(shù)目為20個(gè)，實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)每個(gè)群體為30個(gè)，均達(dá)到對家養(yǎng)動物遺傳多樣性檢測的要求，可以很好地反映壩上長尾雞保種群遺傳多樣性的現(xiàn)狀。

表4 F-statistics統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

圖1 4個(gè)品種的UPGMA/DA聚類

3.2 品種內(nèi)遺傳多樣性分析本研究檢測的20個(gè)微衛(wèi)星座位中，19個(gè)微衛(wèi)星座位屬于高度多態(tài)座位，只有1個(gè)座位MCW0103屬于低度多態(tài)座位，為0.242 3，而且群體平均多態(tài)信息含量為0.673 6，平均等位基因數(shù)為12.65，平均期望雜合度為0.747 2，顯示出豐富的遺傳多樣性和較高的選擇潛力。這說明本研究所選擇的20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)所提供的多態(tài)信息含量豐富，樣本數(shù)量合理，用其分析遺傳多樣性具有較高的有效性和可靠性。

本研究所研究的4個(gè)雞品種中，壩上長尾雞的遺傳多樣性最高，為0.747 2。太行雞的遺傳多樣性相對較低，為0.698 0，這與實(shí)際情況是一致的。壩上長尾雞近年來才開始進(jìn)行系統(tǒng)選育，群體的整齊度較差，而太行雞（河北柴雞）主產(chǎn)于河北省境內(nèi)太行山沿線等地，經(jīng)長期自然選育而成的蛋肉兼用型地方品種。太行雞養(yǎng)殖已從群眾自發(fā)散養(yǎng)發(fā)展到規(guī)模養(yǎng)殖，初步形成了太行雞規(guī)模化和生態(tài)化養(yǎng)殖［9］，所以群體的整齊度較好。這也說明壩上長尾雞保種群具有豐富的遺傳多樣性和較高的選擇潛力，這與壩上長尾雞保種群群體PIC整體上為高度多態(tài)性結(jié)果是一致的。同時(shí)也說明采用的保種方法效果明顯，有效的保存了群體的遺傳變異。

3.3 品種間的遺傳分化本研究的4個(gè)地方雞品種聚為3類。廣西麻雞與太行雞的遺傳距離最近，在聚類分析中聚為一起。廣西麻雞的特征可概括為“一麻、兩細(xì)、三短”。一麻是指雞體羽以棕黃麻羽為主；兩細(xì)是指頭細(xì)、脛細(xì)；三短是指頸短、體軀短、脛短［10］；太行雞（河北柴雞）的特征性狀表現(xiàn)為：毛色花各色各異，不是純粹一色，體型好，青腳細(xì)腿，大小適中［11］。這2個(gè)地方品種的羽色、形態(tài)較相近，聚類分析中首先聚在一起，然后又與壩上長尾雞聚在一起，壩上長尾雞采樣時(shí)也是以麻羽為主［12］；北京油雞的毛色是純色［1］，在聚類分析中，獨(dú)自聚為一類。UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果與這些雞品種的外貌形態(tài)相吻合，同時(shí)這也說明微衛(wèi)星標(biāo)記分析雞品種親緣關(guān)系的可靠性。

4 結(jié)論

本研究檢測的20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，19個(gè)位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性，各群體均顯示較高的期望雜合度，壩上長尾雞最高，為0.747 2，太行雞相對比較低，為0.698 0。整個(gè)群體總的遺傳分化中，約有9.8%源于品種間的差異，90.2%源于品種內(nèi)個(gè)體之間的差異。群體內(nèi)的近交系數(shù)不高，表明壩上長尾雞這一地方品種具有高度的遺傳多樣性，有較高的保種潛力，可用于構(gòu)建核心種質(zhì)資源群。聚類結(jié)果與這些雞品種的羽色等外貌形態(tài)基本吻合。這也說明微衛(wèi)星標(biāo)記分析雞品種親緣關(guān)系的可靠性。

［1］國家畜禽遺傳資源委員會組編.中國畜禽遺傳資源志（家禽志）［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

［2］屠云潔，陳寬維，沈見成，等.利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析四川8個(gè)地方雞品種遺傳多樣性［J］.遺傳，2005，27（5）：724-728.

［3］李俊營，詹凱，劉偉，等.安徽省3個(gè)地方雞品種的遺傳多樣性分析［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，32（1）：20-24.

［4］包文斌，陳國宏，李碧春，等.紅色原雞和中國家雞遺傳多樣性及親緣關(guān)系［J］.中國科學(xué)C輯：生命科學(xué)，2008，38（1）：43-51.

［5］高玉時(shí)，楊寧，李慧芳，等.我國地方雞品種保種群微衛(wèi)星多態(tài)性分析與分子標(biāo)記檔案的建立［J］.遺傳，2004，26（6）：859-864.

［6］杜胭脂，陳玉霞，康麗，等.汶上蘆花雞種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45（10）：1616-1621.

［7］郝晨陽，王蘭芬，賈繼增，等.SSR熒光標(biāo)記和銀染技術(shù)的比較分析［J］.作物學(xué)報(bào)，2005，31（2）：144-149.

［8］包文斌，束婧婷，許盛海，等.樣本量和性比對微衛(wèi)星分析中群體遺傳多樣性指標(biāo)的影響［J］.中國畜牧雜志，2007，43（1）：6-9.

［9］郭偉婷，呂彥英.太行雞養(yǎng)殖發(fā)展中存在的問題及建議［A］.“創(chuàng)新驅(qū)動、生態(tài)養(yǎng)殖、轉(zhuǎn)型發(fā)展”論文集［C］.2014.

［10］張華智，韋子先，韋玨靈，等.靈山香雞品種資源選育效果初報(bào)［J］.中國畜禽種業(yè)，2014，（11）：136-138.

［11］魏忠華，鄭長山，宣鳳答，等.太行雞選育研究進(jìn)展［A］.2010畜牧業(yè)與低碳經(jīng)濟(jì)科技論文集［C］.石家莊，2010.

［12］朱文進(jìn)，李祥龍，周榮艷，等.壩上長尾雞保種技術(shù)方案［J］.中國家禽，2014，36（4）：46-48.

S831.2

：A

：0258-7033（2015）19-0013-04

2014-12-30；

2015-02-07

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)攻關(guān)計(jì)劃（15226302D）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（QN2015023）

關(guān)學(xué)敏（1977-），女，山西河曲人，副教授，研究方向?yàn)閯游镞z傳育種，E-mail：guanxueming109@163.com

*通訊作者：李祥龍（1963-），男，河北豐南人，博導(dǎo)，教授，研究方向?yàn)閯游镞z傳育種，E-mail：lixianglongcn@yahoo.com