郝志香

(河南省新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 新鄉(xiāng) 453000)

綿羊痘病又名綿羊“天花”，是由羊痘病毒引起綿羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病，只感染綿羊。其特征是在病羊的口、唇、乳房、尾根等無(wú)毛或少毛部位皮膚粘膜發(fā)生痘疹。一般于冬末春初多發(fā)，死亡率高，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)危害較大。2015年10月新鄉(xiāng)市某羊場(chǎng)發(fā)生一起綿羊痘病例。

1 流行病學(xué)調(diào)查

該羊場(chǎng)共養(yǎng)殖有小尾寒羊130只，其中羔羊20只，起初只有羔羊發(fā)病，一周后成羊陸續(xù)感染，但是癥狀較輕微，只有精神不振，食欲減退情況，羔羊癥狀明顯，發(fā)病羔羊精神不振，食欲減退，體溫升高至40℃，眼瞼紅腫，咬牙，流口水，尾巴和四肢有紅斑和丘疹，無(wú)腹瀉，羔羊死亡率100%，抗生素治療無(wú)效。初步懷疑感染小反芻獸疫病毒或者綿羊痘病毒。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 樣品采集與處理

采集發(fā)病羊的鼻腔拭子和咽喉拭子各5份，置入1.5mL離心管內(nèi)，加入500μL生理鹽水充分混勻，8000rpm離心2min，取上清液100μL與1.5mL滅菌離心管中備用。

2.2 核酸提取

核酸提取采用RNA/DAN純化試劑盒（購(gòu)自世紀(jì)元亨），具體操作方法如下：取已處理樣品，加入裂解液600μL,充分顛倒混勻，室溫靜置3～5min；將液體吸入吸附柱中，13000rpm離心30s；棄去收集管中的液體，加入600μL 洗液，13000rpm離心30s，重復(fù)一次；棄去收集管中液體，13000rpm空柱2min，以除去殘留液；將吸附柱移入新的1.5mL離心管中，向中央加入洗脫液25～50μL，室溫靜置1min，13000rpm離心30s，離心管中的液體即為病毒核酸模板。

2.3 小反芻獸疫病毒RT-PCR鑒定

小反芻獸疫病毒RT-PCR鑒定采用小反芻獸疫病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病研究中心），具體操作方法如下：每份被檢樣品使用1個(gè)PCR反應(yīng)管，每管中依次加入：RT-PCR反應(yīng)液21μL，酶混合液1μL，被檢樣品中提取的病毒核酸模板溶液3μL，陽(yáng)性對(duì)照用反應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照品做模板（加3μL），陰性對(duì)照用無(wú)RNA酶污染的純水做模板（加3μL），最終體積為25μL。加樣后，將PCR管置于RCR儀內(nèi)進(jìn)行如下反應(yīng)：50℃，30min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；然后94℃，2min進(jìn)行Taq酶的激活；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增條件為94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，30sec）；最后進(jìn)行72℃，7min的延伸。RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，取RT-PCR產(chǎn)物5μL在EB染色的1.5%瓊脂凝膠中電泳，30min。電泳結(jié)束后，將瓊脂凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

2.4 綿羊痘病毒（SPPV）熒光PCR鑒定

綿羊痘病毒（SPPV）熒光PCR鑒定采用綿羊痘病毒（SPPV）核酸擴(kuò)增試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎㄙ?gòu)自廣州維伯鑫生物科技有限公司），具體操作方法如下：每份被檢樣品使用1個(gè)PCR反應(yīng)管，每管中依次加入：SPPV反應(yīng)液20μL，酶液1μL，被檢樣品中提取的病毒核酸模板溶液4μL，陽(yáng)性對(duì)照加陽(yáng)性質(zhì)控4μL，陰性對(duì)照加陰性質(zhì)控4μL，總體積25μL，蓋好管蓋，短暫離心。將待檢測(cè)PCR反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)，熒光通道選擇：熒光通道（ReporterDye）FAM，淬滅通道（QuencherDye）NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。反應(yīng)體系設(shè)置為25μL。循環(huán)參數(shù)設(shè)置：94℃，2min進(jìn)行Taq酶的激活，不收集熒光信號(hào)；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（94℃，15sec，不收集熒光信號(hào)；55℃，30sec，收集熒光信號(hào)）。

3 結(jié)果分析判定

3.1 小反芻獸疫病毒RT-PCR結(jié)果分析判定

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：如果待檢樣品出現(xiàn)于陽(yáng)性對(duì)照大小一致的擴(kuò)增條帶（大小約為350bp），則結(jié)果判為普通RT-PCR陽(yáng)性，否則結(jié)果判為普通RT-PCR陰性。電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察（江蘇捷達(dá)），見(jiàn)圖1。陽(yáng)性對(duì)照在Marker2000標(biāo)示的250bp到500bp之間出現(xiàn)了一條亮帶，陰性對(duì)照和待檢樣品均無(wú)亮帶，判為小反芻獸疫普通RT-PCR陰性，說(shuō)明該羊群未感染小反芻獸疫病毒。

圖2.RT-PCR鑒定小反芻獸疫檢測(cè)結(jié)果

3.2 綿羊痘病毒（SPPV）熒光PCR結(jié)果分析判定

結(jié)果判斷：1）陽(yáng)性：檢測(cè)樣品Ct值小于等于35.0，且曲線(xiàn)有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期；2）可疑：檢測(cè)樣本Ct值大于35.0，重復(fù)一次試驗(yàn)，如果Ct值仍小大于35.，且曲線(xiàn)有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)，為陽(yáng)性，否則，為陰性；3）陰性：檢測(cè)不到樣品Ct值。

圖2.熒光PCR鑒定SPPV檢測(cè)結(jié)果

待檢樣品綿羊痘定都（SPPV）熒光PCR結(jié)果見(jiàn)圖2，根據(jù)結(jié)果可以看出，5份鼻腔拭子提取物和5份口腔拭子提取物均檢出有綿羊痘病毒，說(shuō)明該群小尾寒羊感染有綿羊痘病毒。

4 后續(xù)處理

綿羊痘被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病，為了預(yù)防、控制盒消滅綿羊痘，根據(jù)《綿羊痘山羊痘防治技術(shù)規(guī)范》，當(dāng)?shù)孬F醫(yī)主管部門(mén)將該羊群全部撲殺，并進(jìn)行無(wú)害化處理。