楊

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

油菜種子蛋白質(zhì)提取方法研究

楊柳，李海林，張振乾*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

通過對(duì)比改進(jìn)的Tris-HCl法、酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和DTT/丙酮法4種方法提取油菜未成熟種子蛋白質(zhì)，以期找到合適的蛋白質(zhì)提取方法。結(jié)果表明，TCA/丙酮沉淀法和DTT/丙酮法所得蛋白質(zhì)沉淀較多，顏色亮白，效果較好。進(jìn)一步通過定量分析及雙向電泳圖譜的比較分析表明，TCA/丙酮沉淀法在2-DE圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)較多，分布均勻，圖像清晰，而DTT/丙酮法相對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中TCA/丙酮法檢測(cè)到較少的蛋白質(zhì)點(diǎn)外，2-DE圖譜上有明顯的縱條紋。因此TCA/丙酮沉淀法為提取油菜種子中蛋白質(zhì)的最優(yōu)方法。

油菜；蛋白質(zhì)；提取方法；雙向電泳

利用各種預(yù)分離技術(shù)降低樣品體系復(fù)雜性，分離富集蛋白質(zhì)并與現(xiàn)有的分離技術(shù)相結(jié)合，大幅度提高了蛋白質(zhì)的檢測(cè)率［1，2］。目前常用的提取蛋白質(zhì)的方法有：（1）PEG沉淀法，能夠簡(jiǎn)單、快速地富集蛋白質(zhì)的預(yù)分離方法；（2）TCA丙酮沉淀法［3］，具有降低次生代謝物質(zhì)的干擾、減少蛋白質(zhì)降解等優(yōu)點(diǎn)；（3）酚法［4］，利用Tris-飽和酚的特性。酚是蛋白質(zhì)的良好溶劑，在樣品制備過程中，蛋白質(zhì)和脂類溶于酚相，鹽、核酸、多酚和多糖等可溶性物質(zhì)進(jìn)入水相；（4）Tris-HCl法［5］，該方法在膜蛋白質(zhì)和疏水性蛋白質(zhì)的提取方面有所改善。用含SDS的Tris -HCl與TCA丙酮聯(lián)合使用提取蛋白質(zhì)，用80%的丙酮洗滌以除去水溶性雜質(zhì)（包括高濃度的鹽離子），比TCA丙酮法利用高速離心與丙酮洗滌的方法能更有效地排除雜質(zhì)，也比傳統(tǒng)的脫鹽和透析方法要省時(shí)省力。此外，還有二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法［6］、酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法［7］、Mg/NP-40提取法［5］、Mg/NP-40/PEG4000/TCA/丙酮提取法［8］、試劑盒提取法等。隨著雙向電泳的發(fā)展，結(jié)合雙向凝膠電泳的預(yù)分離技術(shù)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)中分析蛋白質(zhì)的有力工具。

油菜是我國(guó)第一大油料作物，研究其脂肪酸合成機(jī)理是目前油菜分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究備受關(guān)注，細(xì)胞或組織中受體分子、信號(hào)分子等參與基因表達(dá)調(diào)控即基因調(diào)控［9］均需要蛋白質(zhì)的參與。授粉后20～35 d為油菜種子脂肪酸形成關(guān)鍵期［10］，本試驗(yàn)以此時(shí)期的種子為材料，對(duì)各種提取方法進(jìn)行研究，以期找到適合雙向電泳的蛋白質(zhì)提取方法。

1 材料與方法

1.1供試材料

湘油15號(hào)授粉后20～40 d油菜種子。

1.2試劑

1.2.1 酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法試劑

TCA/丙酮溶液（含10%（W/V）三氯乙酸，0.07%DTT），0.1 M醋酸銨的甲醇溶液。

1.2.2 改良Tris-HCl法試劑

蛋白質(zhì)提取液（50 mM Tris-HCl，pH 8.5，100 mM KCl，0.07%（W/V）DTT，30%甘油），80%丙酮，蛋白質(zhì)提取緩沖液（0.1M Tris-HCl，pH 6.8，0.5% SDS，10%甘油，0.07%DTT），10%TCA/丙酮，80%冷丙酮。

1.2.3 TCA丙酮沉淀法試劑

樣品提取液A：10%TCA，0.07%DTT，1 mM PMSF的丙酮溶液，-20℃保存；樣品提取液B：0.07%DTT，1 mM PMSF 100%的丙酮溶液，-20℃保存。

1.2.4 二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法試劑

抽提裂解液（pH 8.0）：Lysis Buffer0.1M Tris-HCl（12.44 g）；1.4 M NaCl（81.816 g）；0.02 M Na2EDTA（7.45 g）；2%CTAB（20 g）；0.1%DIECA（1 g）；2%PVP K-30（20 g）加0.2%β-巰基乙醇后調(diào)pH值至8.0；碘代乙酰胺2-碘乙酰胺（IAM）。

1.2.5 雙向電泳試劑

（1）瓊脂糖封膠液配制：低熔點(diǎn)瓊脂糖0.5 g， Tirs 0.303 g，甘氨酸1.44 g，SDS 1 mL（10%SDS），溴酚藍(lán)100μL（1%溴酚藍(lán)），ddH2O定容到100 mL。

（2）裂解液：7.0 M尿素，2.0 M硫尿，4% CHAPS，30 mM Tris-HCl，pH 9.0（Bio-Rad）。

（3）水化液：2.0 M硫脲，7.0 M尿素，2% CHAPS（不含DTT，不含Bio-Lyte）（Bio-Rad）。

（4）平衡母液：6 M尿素，50 mM Tris-HCl，20%甘油，2%SDS（Bio-Rad）。

（5）10×電泳緩沖液：250 mM Tris，1.92 M glycine，1%SDS，pH 8.3（Bio-Rad）。

（6）30%丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=29∶1（Bio -Rad）。

1.3蛋白質(zhì)提取

1.3.1 改良Tris-HCl法

對(duì)谷瑞升［11］等人方法進(jìn)行部分修改。操作步驟為，取1 g油菜種子液氮研磨，準(zhǔn)確稱取0.5 g粉末至10 mL離心管中，加入PVPP 0.3 g和蛋白質(zhì)提取緩沖液4.5 m L（0.1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，0.5%SDS，10%甘油，0.07%（W/V）DTT），樣品混勻后置4℃震蕩浸提1 h，以充分溶解蛋白質(zhì)，之后12 000 g 4℃離心20 min，吸取上清800μL，加入8 mL-20℃10%TCA/丙酮，混勻后置-20℃沉降蛋白質(zhì)3 h，10 000 g 4℃離心30 min，棄上清，加入冷丙酮5 m L，渦旋，于-20℃下放置30 min，于10 000 g離心30 min，重復(fù)3次；加入冷的80%丙酮，渦旋，于-20℃下放置30 min，于10 000 g下離心30 min，重復(fù)1次；于室溫下風(fēng)干10～15 min使丙酮完全揮發(fā)，置于-80℃下保存。

1.3.2 TCA丙酮沉淀法

對(duì)Damerval C等人［3］的方法進(jìn)行部分修改。取1 g，-80℃保存的油菜種子置于研缽中，迅速加入液氮，再加入少量的PVPP粉，研磨至細(xì)粉狀，溫度始終低于4℃。加入預(yù)冷保存的10倍體積的樣品提取液A，于-20℃沉淀過夜；第二天4℃、15 000 r/min，離心30 min，棄上清，再加入預(yù)冷保存的10倍體積的樣品提取液B，混勻，沉淀1～2 h，4℃、15 000 r/min，離心30 min，棄上清，重復(fù)此步4次，直到粉末變成白色。最后4℃離心30 min，棄上清，沉淀制成干粉，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法

對(duì)范龍泉等［7］方法稍加修改，分別用Triton-X100和甘油替換原緩沖液中的SDS和蔗糖。稱1 g種子研磨成粉，轉(zhuǎn)至15 mL離心管，加入10倍體積-20℃預(yù)冷TCA/丙酮溶液。-20℃沉淀30 min后離心，棄上清；沉淀分別用0.1M醋酸銨甲醇溶液和冷丙酮清洗各1次，離心后沉淀室溫干燥。按100 mg干粉加入0.5～0.8 mL提取液和等體積的Tris飽和酚（pH＞7.5），4℃下放置30 min；4℃，10 000 g離心15 min分相。將酚相轉(zhuǎn)至另一干凈離心管，加入5倍體積預(yù)冷的含0.1 M醋酸銨的甲醇溶液，渦旋30 s，-20℃沉降過夜。離心，棄上清；沉淀分別用0.1 M醋酸銨甲醇溶液、冷丙酮和80%冷丙酮清洗各1次。離心，沉淀冷凍干燥后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法

對(duì)曾廣娟等［6］方法稍加修改。取1 g種子，在液氮低溫條件下研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)進(jìn)50 mL離心管；加入適量Lysis Buffer 3，加入終濃度1 mM PMSF、2 mM EDTA混勻，冰上放置5 min后加入終濃度10 mM DTT，冰浴超聲5 min（2 sec/3 sec）；4℃條件下18 000 g離心15 min，取上清；往上清中加入5倍體積的10%TCA冷丙酮，加入終濃度10 mM DTT，混勻，-20℃沉淀蛋白質(zhì)液過夜；4℃條件下12 000 g離心25 min，棄上清；往沉淀中加入適量冷丙酮、終濃度為10 mM DTT，搗碎沉淀，-20℃沉淀30 min，4℃條件下30 000 g離心15 min，棄上清；重復(fù)上一步驟3次，至上清澄清；風(fēng)干沉淀中殘余丙酮后，加入適量Lysis Buffer 3，加入終濃度10 mM DTT，冰浴超聲5 min（2 sec/3 sec）；4℃條件下30 000 g離心15 min，取上清；往上清中加入終濃度10 mM DTT，56℃水浴1 h；加入終濃度55 mM IAM，暗室放置45 min；加入5倍體積的冷丙酮，-20℃沉淀蛋白質(zhì)液過夜；4℃條件下30 000 g離心15 min除上清；沉淀冷凍干燥后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4雙向電泳方法

1.4.1 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

用Bradford法［12］測(cè)量出蛋白質(zhì)濃度后，分裝保存在-80℃冰箱。

1.4.2 等電聚焦

按照表1程序進(jìn)行等電聚焦。

表1 等電聚焦程序

1.4.3 第二向SDS電泳

第二向SDS-PAGE采用分離膠濃度為12%。用低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖，25 mM Tris，198 mM甘氨酸，0.1%SDS，痕量溴酚蘭）封閉。待封膠液凝固后，在酸性端加相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，進(jìn)行第二向垂直電泳。5 w/gel恒功率電泳，待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后，再15 w/gel恒功率電泳，直到溴酚藍(lán)前沿到達(dá)距玻璃板底部0.5～1 cm處，結(jié)束電泳，準(zhǔn)備剝膠與染色。

1.4.4 染色

考馬斯亮藍(lán)染色ddH2O洗3次，每次15 min，12%TCA固定2 h后，ddH2O洗3次，每次15 min。20%甲醇，1.6%磷酸，8%硫酸銨和0.08%考馬斯亮藍(lán)G250染色16～24 h，ddH2O漂洗脫色。

1.4.5 圖像分析

用PDQest8.0圖像分析軟件對(duì)掃描圖像分析差異點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1不同提取方法的比較

高油酸油菜授粉20 d后種子中含有大量的色素、酚等次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在會(huì)嚴(yán)重影響第一向的等電聚焦。為了獲得高質(zhì)量的2-DE蛋白質(zhì)樣品，本試驗(yàn)采用了4種不同的蛋白質(zhì)提取方法，即TCA/丙酮沉淀法、二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法、改良的Tris-HCl法和酚-甲醇/醋酸銨沉淀法處理樣品。4種提取方法獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)量有所差異（表1）。改良的Tris-HCl法提取的蛋白質(zhì)沉淀雖然步驟簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短、操作容易，但是沉淀顏色偏黃，而且里面離子含量過多，聚焦容易失敗，不利于雙向電泳。酚-甲醇/醋酸銨沉淀法所得蛋白質(zhì)沉淀不多，顏色較白，但是步驟較繁瑣、耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，蛋白質(zhì)損失較多。TCA/丙酮沉淀法和二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法所得蛋白質(zhì)沉淀干重差不多，顏色相近，都容易溶于裂解液，蛋白質(zhì)凈產(chǎn)量都高，而且在步驟、操作性、提取時(shí)間上相差不大。綜合考慮，二方法在現(xiàn)階段提取蛋白質(zhì)都為較合適的方法，且都優(yōu)于改良的Tris-HCl法和酚-甲醇/醋酸銨沉淀法。尋找最優(yōu)方法，需通過進(jìn)一步定量分析比較。

表2 不同提取方法所得油菜種子蛋白質(zhì)

2.2 TCA/丙酮沉淀法和二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法的對(duì)比

當(dāng)Bradford工作液考馬斯亮藍(lán)G-250和蛋白質(zhì)在酸性條件下結(jié)合時(shí)，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與595 nm的吸光度成正線性相關(guān)關(guān)系（圖1）。

圖1 定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由SDS-PAGE圖譜（圖2）可見，TCA/丙酮沉淀法（B）與二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法（A）相比，蛋白質(zhì)條帶稍強(qiáng)，在14 kD和20 kD處條帶較強(qiáng)。從定量信息（表3）和電泳圖譜看，兩個(gè)樣品的蛋白質(zhì)總量都是合格的，能繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 定量信息

注：樣品A表示用二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法得到的，樣品B表示用TCA/丙酮沉淀法得到的。

圖2 兩種蛋白質(zhì)提取方法的SDS-PAGE圖譜比較

2.3兩種蛋白質(zhì)提取方法效果比較

二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法和TCA/丙酮沉淀法提取的油菜種子蛋白質(zhì)得到的2-DE圖譜如圖3所示。在相同雙向電泳條件下，用TCA/丙酮沉淀法制備的蛋白質(zhì)樣品（圖3-a）的雙向電泳結(jié)果優(yōu)于二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法（圖3-b），主要是得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)聚合較好，凝膠背景比較清晰，圖譜質(zhì)量好且縱橫紋較少，可能是二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法提取的樣品中蛋白質(zhì)有所降解。經(jīng)PDQest8.0圖像分析軟件對(duì)2種蛋白質(zhì)提取方法得到的2-DE圖譜進(jìn)行分析，在TCA/丙酮沉淀法樣品的2-DE圖譜（圖3-a）中分別檢測(cè)到558個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)；而在二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法的2-DE圖譜（圖3-b）中分別檢測(cè)到331個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，明顯比TCA/丙酮沉淀法少227個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。而且TCA/丙酮沉淀法在操作方面也優(yōu)于二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法。因此，對(duì)于油菜種子蛋白質(zhì)提取方法的研究可以發(fā)現(xiàn)，TCA/丙酮沉淀法比較好。

圖3 兩種蛋白質(zhì)提取方法的2-DE圖譜比較

3 小結(jié)與討論

3.1蛋白質(zhì)提取方法比較

蛋白質(zhì)的提取方法中最常用的是TCA/丙酮沉淀法，在提取過程中組分損失較少，具有廣泛的適用性，在動(dòng)植物組織［13］以及微生物材料中都能取得很不錯(cuò)的分離效果，而且在2-DE圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)較多，分布均勻，適宜油菜種子中蛋白質(zhì)的提取。改良Tris-HCl提取法除了分離到較多的中等分子量的蛋白質(zhì)外，還得到了比例相當(dāng)?shù)母叻肿恿亢偷头肿恿康鞍踪|(zhì)。但是Tris堿雖可防止蛋白質(zhì)的水解，卻引入鹽離子，會(huì)導(dǎo)致IEF（等電點(diǎn)聚焦）電壓過低，從而影響聚焦。酚-甲醇/醋酸銨沉淀法分離得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)的比例在堿性區(qū)域（p I 4～7）比Tris-HCl提取法得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)的比例高，但是總量相對(duì)較少。二硫蘇糖醇（DTT）/丙酮法所得蛋白質(zhì)沉淀多，純度高，易溶于裂解液，且蛋白質(zhì)凈產(chǎn)量都高，但在本實(shí)驗(yàn)中比TCA/丙酮法檢測(cè)到蛋白質(zhì)點(diǎn)少，且2-DE圖譜上有明顯的縱條紋。

3.2蛋白質(zhì)提取方法對(duì)雙向電泳的影響

蛋白質(zhì)樣品的制備直接影響雙向電泳的分辨率和重復(fù)性，特別是植物細(xì)胞有很厚的酚類、醌類等次生代謝物質(zhì)，如果樣品處理不當(dāng)，這些物質(zhì)會(huì)干擾第一向IEF，同時(shí)不恰當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)沉淀方法會(huì)導(dǎo)致一些膜蛋白質(zhì)和疏水性蛋白質(zhì)的丟失［14］。植物組織的蛋白質(zhì)組成是動(dòng)態(tài)的，至今沒有一種通用的制備方法能將樣品中的蛋白質(zhì)全部提取出來。蛋白質(zhì)制備方法雖然很多，但都盡可能多的提高樣品蛋白質(zhì)的溶解度，提取最大量的蛋白質(zhì)，減少蛋白質(zhì)損失；減少雙向電泳干擾物（主要有鹽類、脂類、多糖和核酸等），以免其破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用。

［1］ Espagne C，Martinez A，Valot B，et al.Alternative and effective proteomic analysis in Arabidopsis［J］.Proteomics，2007，7：3788-3799.

［2］ Widjaja I，Naumann K，Roth U，et al.Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low-abundance proteins differentially regulated during plant defense［J］.Proteomics，2009，9：138-147.

［3］ Damerval C，Vienne D，Zivy M，et al.Technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling protein［J］.Electrophoresis，1986，7（1）：52-54.

［4］ Isaacson T，Damasceno CM，Saravanan RS，et al.Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissu［J］.Nature Protocol，2006，1：769-774.

［5］ 梁書劍，張 萌，王 巍，等.雙向電泳比較兩種方法獲得的水稻葉片蛋白質(zhì)［J］.生物學(xué)雜志，2009，26（3）：68-71.

［6］ 曾廣娟，李春敏，張新忠，等.適于SDS-PAGE分析的蘋果葉片蛋白質(zhì)提取方法［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（2）：75-78.

［7］ 范龍泉，胡新明，趙進(jìn)峰，等.甜瓜幼苗根系總蛋白質(zhì)提取方法的篩選及其電泳條件的建立［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（4）：33-36，50.

［8］ 鐘 俐，馬成梅，梁永增，等.甜瓜葉片中Rubisco的去除及雙向電泳體系的優(yōu)化［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2012，48（3）：303-309.

［9］ G?rg A，Weiss W，Dunn MJ.Current two-dimensional eletrophoresis technology for proteomics［J］.Proteomics，2004，4：3665-3685.

［10］Peng Qi，Hu Yan，Du Pei-Fen，et al.Construction of SSH library with different stages of seeds development in Brassica napus L.［J］.Acta Agronomica Sinica，2009，35（9）：1576-1583.

［11］谷瑞升，劉群錄，陳雪梅，等.一種省時(shí)高效的木本植物蛋白質(zhì)雙向電泳分析方法［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21（5）：7-10.

［12］Bradford MM.A rapid method for the quantification ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72：248-254.

［13］Wang X，Chang L，Wang GC，et al.Protein extraction from the earthworm Eisenia fetidafor 2-DE［J］.Proteomics，2010，10（5）：1095-1099.

［14］羅澤宇，楊粵軍，劉選明.擬南芥蛋白質(zhì)組研究中雙向電泳技術(shù)條件的優(yōu)化［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2008，17（4）：539-543.

Study on Protein Extraction Methods for Seeds of Rapeseed

YANG Liu，LIHai-lin，ZHANG Zhen-qian*
（College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

To screen optimal protein extraction method for immature seeds of rapeseed，four methods，the improved Tris-HClmethod，phenol extraction-methanol/ammonium acetate precipitation，TCA/acetone precipitation and DTT/acetone method，were compared.The results showed that the TCA/acetone precipitation method and DTT/acetonemethod could gainmore protein precipitation，more brightwhite color，and the effectwas better.Further quantitative analysis and twodimensional electrophoresis comparative analysis showed that TCA/acetone precipitation method could gain more protein points on 2-DEmap，and the distribution was uniform，the image was clear，while DTT/acetonemethod detected less protein points，and the 2-DE map had obvious vertical stripes.So TCA/acetone precipitationmethod was the optimal protein extractionmethod for seeds of rapeseed.

rapeseed；protein；extractionmethod；two-dimensional electrophoresis

Q51；S565.4

A

1001-5280（2015）01-0011-05 DOI：10.3969/j.issn.1001-5280.2015.01.04

2014 10- 28

楊 柳（1982-），女，湖南湘陰人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事油菜育種研究，Email：yxtl914@sohu.com。*通信作者。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201240）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)青年基金（12QN27）。