李*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；2株洲市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南株洲412007；3國家海洋局第一海洋研究所生態(tài)中心，山東青島266061）

低溫對(duì)茶陵野生稻總基因組導(dǎo)入栽培稻后代耐冷性生理指標(biāo)的影響

李穎邦1，康敏2，宋偉3，程鵬1，洪亞輝1*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；2株洲市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南株洲412007；3國家海洋局第一海洋研究所生態(tài)中心，山東青島266061）

選用茶陵野生稻總基因組導(dǎo)入冷敏感品種R9810獲得的導(dǎo)入后代Km16為材料，以受體品種R9810為對(duì)照，在幼苗期低溫脅迫下，分別測定植株丙二醛、生長素、脫落酸含量以及SOD、CAT、POD活性。結(jié)果表明，導(dǎo)入后代Km16植株的丙二醛含量略低于R9810，而生長素、脫落酸含量則明顯高于R9810。同樣，Km16植株的3種酶活性也產(chǎn)生了明顯的變化。

水稻；幼苗；耐冷性；生理指標(biāo)

一般以抗氧化物酶活性、丙二醛含量以及植物激素含量變化作為指標(biāo)來解釋作物存在抗寒性狀能力的原因以及受到冷傷害時(shí)作物有效應(yīng)對(duì)的生理機(jī)制［1，2］。研究表明，植物細(xì)胞在遭受到低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧類物質(zhì)（包括O-2、H2O2以及·OH等）的水平會(huì)顯著提高，從而造成細(xì)胞的損害［3］。一些抗氧化物酶，如：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）都是有效保護(hù)細(xì)胞免受活性氧損害的保護(hù)酶類［4］。對(duì)低溫敏感的植物，其細(xì)胞抵御由低溫而產(chǎn)生的氧化損傷能力，很大程度上受到抗氧化類物質(zhì)如SOD、POD、CAT等表達(dá)量的抑制［5］。丙二醛（MDA）是植物體組織器官衰老或者受到某些逆境脅迫下細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化形成的產(chǎn)物，MDA含量愈高，則細(xì)胞膜受到的損害程度就愈大［6］。許多研究以MDA含量的變化作為細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的判斷指標(biāo)，用來表明細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化程度和對(duì)逆境脅迫的抵御情況［7］。脫落酸（ABA）和生長素（IAA）是兩種參與植物應(yīng)答生物和非生物脅迫的重要激素［8～10］。已有研究指出，在逆境脅迫下植物體內(nèi)的ABA與鈣信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在相互調(diào)控機(jī)制，ABA含量的變化與鈣信號(hào)的出現(xiàn)和轉(zhuǎn)導(dǎo)有密切的聯(lián)系［11～13］。

野生稻具有抗低溫、抗旱、抗鹽堿等多種優(yōu)良的生物性狀，其基因資源已經(jīng)得到愈來愈多的研究人員的重視［14～16］。本研究以導(dǎo)入茶陵野生稻總基因組的后代Km16與其受體冷敏感品種R9810為對(duì)象，旨在比較其抗氧化物酶活性、MDA含量、植物激素的變化，以對(duì)水稻抗寒機(jī)理進(jìn)行初步探析。

1 材料與方法

1.1茶陵野生稻總基因組導(dǎo)入受體水稻R9810

株洲市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所與湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究室合作，通過花粉管通道法［17］將茶陵野生稻總基因組DNA導(dǎo)入冷敏感品種R9810，得到表型各異的導(dǎo)入后代。對(duì)導(dǎo)入后代進(jìn)行RAPD多態(tài)性分析，并篩選出具有明顯耐寒能力的后代Km16。種子由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究室保存。

1.2水稻幼苗的栽培與處理

將Km16及R9810水稻種子以蒸餾水室溫浸泡2 d，種子出現(xiàn)破胸吐白后將其轉(zhuǎn)移到固體瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)生長。約7 d后長成幼苗，將幼苗移植到含有蛭石的人工基質(zhì)土并轉(zhuǎn)移到人工氣候箱中培養(yǎng)。溫度設(shè)定為30/25℃（光/暗），光照時(shí)間12 h，相對(duì)濕度70%。待水稻幼苗長至3葉期，將人工氣候箱溫度設(shè)置為4℃，光照和相對(duì)濕度不變，低溫處理12 h，每隔3 h取樣1次，剪取幼苗相同部位葉片進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.3測定方法

MDA含量測定采用TBA顯色法［18］；SOD活性測定采用NBT光化還原法［19］；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法［20］；CAT活性測定采用直接紫外分光光度法。植物激素樣品處理方法同文獻(xiàn)［21］，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素研究室測定。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

將數(shù)據(jù)匯總并進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，后進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)（one-way ANOVA）。在方差顯著水平小于0.05時(shí)（p＜0.05）進(jìn)行鄧肯氏多重比較。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 MDA含量變化

如圖1所示，低溫脅迫后Km16與R9810植株MDA含量出現(xiàn)顯著上升（p＜0.05），并在3 h處都達(dá)到最大值，而后MDA的含量出現(xiàn)明顯的下降趨勢（p＜0.05），在9 h處達(dá)到最小值。初始及3 h取樣時(shí)，兩者M(jìn)DA含量差異很?。╬＞0.05），至6 h時(shí)，Km16的MDA含量明顯低于R9810（p＜0.05），而在之后的兩個(gè)取樣點(diǎn)，兩者差異較小（p＞0.05）。存在不同的是，Km16的MDA含量在3 h處達(dá)到最大值后迅速下降，下降速率要比R9810快得多，表現(xiàn)出Km16的MDA含量對(duì)低溫脅迫比R9810更為敏感，反應(yīng)也更為迅速。

圖1 低溫脅迫下Km16與R9810植株MDA含量變化

2.2三種酶活性變化

如圖2所示，Km16的SOD酶活力在低溫脅迫后的9 h之內(nèi)都呈現(xiàn)顯著的上升趨勢（p＜0.05），而低溫脅迫時(shí)間對(duì)R9810的SOD酶活性影響不顯著（p＞0.05）。在脅迫6 h與9 h時(shí)，Km16的SOD酶活性顯著高于R9810（p＜0.05），而在其他時(shí)間，兩者差異較小。

對(duì)POD酶活性的測定結(jié)果（圖3）表明，在受到低溫脅迫時(shí)，兩種材料植株內(nèi)的POD活性顯著低于其正常培養(yǎng)條件下的值（p＜0.05）。在大多數(shù)時(shí)間內(nèi)，Km16與R9810的POD酶活性差異不顯著，但在12 h處，Km16的POD酶活顯著高于R9810（p＜0.05）。

圖2 低溫脅迫下Km16與R9810植株SOD活性變化

圖3 低溫脅迫下Km16與R9810植株P(guān)OD活性變化

CAT酶活力測定結(jié)果（圖4）表明，低溫脅迫下，Km16的酶活性在3 h處達(dá)到最大值，且在大部分時(shí)間內(nèi)顯著高于R9810（p＜0.05）。而在12 h處，兩者酶活性差異較小。

圖4 低溫脅迫下Km16與R9810植株中CAT活性變化

2.3 ABA與IAA含量變化

如圖5所示，Km16與R9810在常溫培養(yǎng)時(shí)其ABA含量差異很小。而在低溫脅迫下，Km16的 ABA含量明顯高于常溫培養(yǎng)時(shí)的值（p＜0.05），并在6 h時(shí)達(dá)到最大值。同時(shí)，在低溫脅迫下，Km16中的ABA含量明顯高于R9810（p＜0.05）。對(duì)于IAA而言（圖6），在低溫脅迫下其含量顯著低于常溫（p＜0.05），同時(shí)在大部分時(shí)間中，Km16的IAA含量顯著高于R9810（p＜0.05）。

圖5 低溫脅迫下Km16與R9810植株中ABA含量變化

圖6 低溫脅迫下Km16與R9810植株中IAA含量變化

3 小結(jié)與討論

MDA作為細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的判斷指標(biāo)，已在水稻抗逆性研究中廣泛應(yīng)用［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，在受到低溫脅迫的12 h之內(nèi)，水稻葉片的MDA含量呈現(xiàn)先升高再下降最后基本持平的趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境下，導(dǎo)入后代Km16與受體材料R9810相比較，雖然植株葉片中的總MDA含量相差較小，但Km16在6 h處首先出現(xiàn)了明顯的下降，這說明在受到低溫脅迫時(shí)，Km16能夠較快地降低MDA含量，比R9810更加積極地響應(yīng)由于低溫造成的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷。

SOD、POD以及CAT是生物體內(nèi)有效的自由基清除劑，在清除機(jī)體內(nèi)多余的超氧陰離子、解除超氧陰離子對(duì)生物體的毒性過程中起著關(guān)鍵性作用，并且能夠有效地維持細(xì)胞內(nèi)的活性氧代謝平衡，起到緩解活性氧毒性，保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)和其他生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的完整性［23］。通過測定導(dǎo)入后代Km16水稻植株的SOD活性表明，在低溫脅迫下其SOD活性明顯上升，且高于受體材料R9810的SOD酶活。Yong等［3］在對(duì)水稻進(jìn)行抗冷能力馴化的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下水稻葉片中的SOD酶活性顯著升高，這一點(diǎn)與筆者的結(jié)果相一致。對(duì)CAT酶活性測定結(jié)果表明，在3 h處導(dǎo)入后代Km16的CAT酶活性顯著增高且高于受體材料R9810。然而通過對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)材料的POD酶活性測定后發(fā)現(xiàn)，低溫條件下其POD酶活性都出現(xiàn)了顯著下降。根據(jù)上述結(jié)果，筆者認(rèn)為POD、SOD、CAT3種酶活處于動(dòng)態(tài)平衡中，在低溫脅迫的12 h之內(nèi)，植株體優(yōu)先調(diào)整并升高了SOD的酶活來抵御低溫?fù)p傷，預(yù)計(jì)在12 h之后CAT和POD的酶活性將會(huì)升高。

ABA是植物抗逆脅迫時(shí)常涉及的生長激素，Km16在受到低溫脅迫后，ABA含量出現(xiàn)了明顯的增長，這可能是其在受到低溫脅迫后，通過提高ABA含量來調(diào)動(dòng)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而達(dá)到積極抵御低溫脅迫帶來的損害［11～13］。通過IAA含量的測定發(fā)現(xiàn)，兩組實(shí)驗(yàn)材料的IAA含量都出現(xiàn)了下降，推測原因是IAA屬于促生長類激素，主要功能是影響植物體的生長發(fā)育，但在逆境條件下，植物體內(nèi)的IAA含量水平會(huì)有所降低，生長速率放緩，以應(yīng)對(duì)不良的生存環(huán)境［24］。另外，導(dǎo)入后代Km16的IAA含量仍是高于R9810的，這可能表明在低溫條件下，Km16的生物活性高于R9810。

［1］ 鄧久英，陳光輝，劉 斌，等.水稻耐冷生理和遺傳機(jī)制研究進(jìn)展［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）：25-28.

［2］ 張衛(wèi)星，朱德峰，林賢青，等.穗生長發(fā)育階段水分逆境對(duì)超級(jí)稻葉片丙二醛含量的影響［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（3）：72-76.

［3］ Yong IK，Ji SS，Nilda RB，etal.Antioxidative enzymesoffer protection from chilling damage in rice plants［J］. Crop Sci，2004，43（6）：2109-2117.

［4］ 李 鋒，賈志紅，沈 宏.低溫脅迫對(duì)作物生理生化的影響及抗低溫助劑的研發(fā)［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（12）：12-14.

［5］ 張智猛，戴良香，宋文武，等.干旱處理對(duì)花生品種葉片保護(hù)酶活性和滲透物質(zhì)含量的影響［J］.作物學(xué)報(bào)，2013，39（1）：133-141.

［6］ 吳 濤，董彥琪，原連莊，等.高溫逆境短期處理下大白菜苗期丙二醛和葉綠素含量變化［J］.長江蔬菜，2012（14）：42-44.

［7］ Becana M，Dalton DA，Moran JF，et al.Reactive oxygen species and antioxidants in legume nodules［J］.Physiology Plant，2000，109（4）：372-381.

［8］ 曲凌慧，車永梅，劉 新，等.ABA和JA等激素參與葡萄對(duì)低溫脅迫的應(yīng)答［J］.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27（1）：36-41.

［9］ 孫寬瑩，陳 彥.植物激素的發(fā)現(xiàn)及生理效應(yīng)的研究［J］.聊城大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，24（2）：58-69.

［10］羅正榮.植物激素與抗寒力的關(guān)系［J］.植物生理學(xué)通訊，1989（3）：1-5.

［11］孫 芳，夏新莉，尹偉倫.逆境脅迫下ABA與鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的相互調(diào)控機(jī)制［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（2）：391-397.

［12］劉子會(huì)，郭秀林，王 剛，等.干旱脅迫與ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［J］.植物學(xué)通報(bào)，2004，21（2）：228-234.

［13］張和臣，尹偉倫，夏新莉，等.非生物逆境脅迫下植物鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制［J］.植物學(xué)通報(bào)，2007，24（1）：114-122.

［14］張金偉，謝建坤，萬 永.我國野生稻資源保護(hù)研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（10）：5015-5016.

［15］高立志，張壽洲，周 毅，等.中國野生稻的現(xiàn)狀調(diào)查［J］.生物多樣性，1996，4（3）：160-166.

［16］范樹國，張?jiān)倬?，?林，等.中國野生稻遺傳資源的保護(hù)及其在育種中的利用［J］.生物多樣性，2000，8（2）：198-207.

［17］龔蓁蓁，沈慰芬，周光宇，等.授粉后外源DNA導(dǎo)入植株技術(shù)——通過花粉管通道進(jìn)入胚囊［J］.中國科學(xué)，1988（6）：611-614.

［18］劉 琳.四川野生假儉草的抗寒性研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2004.

［19］魏安智.仁用杏抗寒機(jī)理研究與抗寒物質(zhì)篩選［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文，2006.

［20］張志良，翟偉青.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：高等教育出版社，2002.65-66.

［21］彭 瓊.花生開花下針期生長素的極性運(yùn)輸及分布研究［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2013.

［22］邱乾棟，呂曉貞，臧德奎，等.植物抗寒生理研究進(jìn)展［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（8）：53-57.

［23］Zhang Q，Chen QH，Ling S，et al.Rice and cold stress：methods for its evaluation and summary of cold tolerancerelated quantitative trait loci［J］.Rice，2014，7：24-26.

［24］趙黎明.植物激素及其對(duì)水稻植株發(fā)育調(diào)控的研究進(jìn)展［J］.北方水稻，2009，39（6）：63-69.

Effects of Low Tem perature on Physiological Indexes of Cold Tolerance in Progeny of Cultivated Rice Be Transferred the Total Genom ic DNA of Chaling W ild Rice

LIYing-bang1，KANG M in2，SONG W ei3，CHEN Peng1，HONG Ya-hui1*
（1 College of Bio-science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Zhuzhou Agricultural Sciences Institute，Zhuzhou，Hunan 412007，China；3 Center for Ecology，the First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao，Shandong 266061，China）

Km16，the progeny of cold-sensitive rice variety R9810 be transferred the total genomic DNA of Chaling wild rice，and controlmaterial R9810 were used to determined the contents ofMDA，IAA，ABA，and activities of SOD，CAT and POD at seedling stage under low temperature stress.The results indicated that the content of MDA was slightly lower in Km16 than that in R9810，while the contents of IAA and ABA in Km16 were significantly higher.Similarly，the activities of SOD，CAT and POD were obviously varied in Km16.

rice；seedling；cold tolerance；physiological indexes

S511.01

A

1001-5280（2015）01-0001-04 DOI：10.3969/j.issn.1001-5280.2015.01.01

2014-10-16

李穎邦（1990-），男，碩士研究生，Email：liyingbang2012@163.com。*通信作者：洪亞輝，教授，Email：161740991@qq.com。

農(nóng)業(yè)部948計(jì)劃項(xiàng)目（2013-Z58）；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金項(xiàng)目（10K031）。