杜民　牛寶珍　劉艷紅　等

摘要：從50條隨機(jī)引物中篩選出10條有效引物，采用RAPD技術(shù)對(duì)蒙自響水河和草壩的2個(gè)鯉魚群體進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：在2個(gè)群體中分別檢測(cè)到47、53個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)分別為44、51個(gè)，平均多態(tài)位點(diǎn)比例分別為93.61%和96.23%；利用Popgene version1.32軟件分析獲得2個(gè)鯉魚群體Shannon信息指數(shù)（I）分別為0.479 9和0.455 7，Neis基因多樣性指數(shù)（H）分別為0.328 7和0.298 4，等位基因觀察數(shù)（Na）分別為1.821 4和1.910 7，有效等位基因數(shù)（Ne）分別為1.584 3和1.487 9，群體間的遺傳相似性系數(shù)為0.958 1，遺傳距離為0.041 9。2個(gè)鯉魚群體間的遺傳分化系數(shù)Gst為0.082 4，表明群體間的遺傳變異占總的遺傳變異的8.24%，群體內(nèi)的遺傳變異占總變異的91.76%。

關(guān)鍵詞：鯉魚；RAPD；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： S917.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0047-03

收稿日期：2014-03-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31360638）；云南省教育廳科學(xué)研究基金重大專項(xiàng)（編號(hào)：ZD2013009）；紅河學(xué)院中青年學(xué)術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目（編號(hào)：2014HB0203）；紅河學(xué)院博士專項(xiàng)（編號(hào)：14BS11）。

作者簡(jiǎn)介：杜民（1974—），男，湖北棗陽(yáng)人，博士，副教授，主要從事水生生物技術(shù)與資源研究。Tel：（0873）3799787；E-mail：du2005min@126.com。

通信作者：劉艷紅，博士，教授，主要從事水域資源與環(huán)境管理政策研究。Tel：（0873）3698575；E-mail：kidliu1968@126.com。自從隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）于1990年由美國(guó)科學(xué)家Williams等和Welsh等分別建立起來[1-2]以后，已在遺傳多樣性的檢測(cè)、物種分類和演化、品種鑒定、種群的親緣關(guān)系、構(gòu)建魚類遺傳連鎖圖譜、魚類育種和雜種優(yōu)勢(shì)等研究方面得到應(yīng)用并且效果良好。陳國(guó)生應(yīng)用RAPD技術(shù)分析了閩江中上游黑脊倒刺鲃和黃顙魚遺傳多樣性[3]。趙凱利用RAPD技術(shù)對(duì)4種鯉科魚類的基因組DNA進(jìn)行了分析，結(jié)果表明鯉亞科2種魚種間相似性明顯高于青海湖裸鯉和草魚種間的相似性，然而另外2個(gè)鯉亞科3種魚與裂腹魚亞科的青海湖裸鯉之間的差異顯著高于鯉亞科鯉與雅羅魚亞科草魚、鯽魚之間的差異[4]。

鯉魚（Cyprinus carpio）屬硬骨魚綱（Osteichthyesu）輻鰭亞綱（Actinopterygii）鯉形總目（Cyprinomopha）鯉科（Cyprinidae），是一種最常見的淡水魚，在各個(gè)淡水水域均有分布，也是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)魚之一。天然水域的污染和過度捕撈利用等原因造成鯉魚棲息環(huán)境嚴(yán)重破壞，因此了解并保護(hù)鯉魚種質(zhì)資源顯得極為迫切。本研究利用RAPD方法對(duì)云南省蒙自市響水河和草壩水體的2個(gè)鯉魚群體進(jìn)行分子遺傳分析，探討其遺傳多樣性，為鯉魚資源的科學(xué)管理和合理開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試魚來自于云南省蒙自市草壩水體和響水河水庫(kù)，每個(gè)水體各采集6尾。取活魚的尾鰭分別裝入1.5 mL離心管中，加入無水乙醇并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1試劑、儀器及基因組DNA提取Taq酶、dNTP、Marker 及10×Buffer（博邁德生物科技公司）；Tris酚（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）；PCR儀：EDC-810（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；紫外透射儀：DYY-11（北京六一儀器廠）；高速離心機(jī)：HC-2062（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。參照杜民等的方法[5]提取鯉魚基因組總DNA并放于 -4 ℃ 冰箱。取5 μL DNA樣品和適量溴酚藍(lán)充分混勻后，利用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，觀察到鯉魚基因組DNA條帶比較清晰，符合RAPD實(shí)驗(yàn)要求（圖1）。

1.2.2引物篩選及RAPD檢測(cè)參照郭勇等三葉崖爬藤RAPD引物篩選[6]。以12尾鯉魚的混合DNA為模板，從50條長(zhǎng)度分別為10 bp的隨機(jī)引物中（部分引物篩選的結(jié)果如圖2所示），篩選出能擴(kuò)增出清晰、條帶數(shù)量適中的10條引物用于擴(kuò)增（表1）。RAPD擴(kuò)增反應(yīng)程序： 94 ℃ 預(yù)變性2 min；然后35個(gè)循環(huán)（94℃變性30s，36℃退火 30s，72℃延伸

表110條隨機(jī)引物的序列

引物 序列引物序列SBSA10GTGATCGCAGSBSC01TTCGAGCCAGSBSA16AGCCAGCGAASBSC02GTGAGGCGTCSBSB05TGCGCCCTTCSBSC04CCGCATCTACSBSB07GTGACGCAGSBSC07GTCCCGACGASBSB08GTCCACACGGSBSC08TGGACCGGTG

2 min）；最后72 ℃延伸5 min。取 5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，5 V/cm電壓；用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描和分析。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析記錄清晰、明亮且重復(fù)性好的條帶。將相同遷移距離的條帶看作同一位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)總條帶數(shù)與多態(tài)性條帶數(shù)。根據(jù)產(chǎn)物的電泳帶型，在相同遷移率上出現(xiàn)帶的記為1，未出現(xiàn)帶的記為0，只記錄清晰且重復(fù)性好的DNA條帶，并計(jì)算相關(guān)參數(shù)。根據(jù)Nei指數(shù)法[7]用Popgene1.32軟件對(duì)2個(gè)鯉魚群體的遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行分析：（1）多態(tài)位點(diǎn)百分率=多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/所測(cè)位點(diǎn)總數(shù)×100%；（2）遺傳相似系數(shù)：F=2NXY/（NX+NY），其中NXY為2群體的共享位點(diǎn)數(shù)，NX為1群體的位點(diǎn)數(shù)，NY為2群體的位點(diǎn)數(shù)；遺傳距離P：P=1-F；（3）基因流Nm=0.5（1-Gst）/Gst；（4）遺傳分化指數(shù)Gst=（Ht-HPOP）/Ht，其中Ht為總?cè)后w的平均多樣度，HPOP為各群體多樣度的平均值。

2結(jié)果與分析

2.1RAPD擴(kuò)增結(jié)果

用篩選到的10條引物對(duì)2個(gè)鯉魚群體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，表2列出了10條引物序列的擴(kuò)增情況。本試驗(yàn)2個(gè)群體中共擴(kuò)增出100個(gè)位點(diǎn)，其中響水河鯉魚群體總條帶數(shù)為47條，其中多態(tài)性條帶有44條，平均多態(tài)位點(diǎn)比例為93.61%；草壩鯉魚群體總條帶數(shù)為53條，其中多態(tài)性條帶有51條，平均多態(tài)位點(diǎn)比例為96.23%，表明該群體遺傳資源豐富，具有較好的遺傳多樣性。

2.22個(gè)鯉魚群體的遺傳多樣性

2個(gè)鯉魚群體多樣性指數(shù)見表3。響水河鯉魚群體和草壩鯉魚群體Shannon信息指數(shù)（I）分別為0.479 9和0.455 7；Neis基因多樣性指數(shù)（H）分別為0.328 7和0.298 4；等位基因觀察數(shù)（Na）分別為1.821 4和1.910 7，有效等位基因數(shù)（Ne）分別為1.584 3和1.487 9。響水河鯉魚群體的Shannon信息指數(shù)（I）高于草壩鯉魚群體的Shannon信息指數(shù)。表210條RAPD引物對(duì)2個(gè)鯉魚群體的擴(kuò)增結(jié)果

引物序列總條帶數(shù)（條）多態(tài)性條帶數(shù)（條）多態(tài)性頻率（%）響水河草壩響水河草壩響水河草壩SBSA10GTGATCGCAG05050100SBSA16AGCCAGCGAA666510088.33SBSB05TGCGCCCTTC431375100SBSB07GGTGACGCAG6565100100SBSB08GTCCACACGG666510088.33SBSC01TTCGAGCCAG5656100100SBSC02GTGAGGCGTC5555100100SBSC04CCGCATCTAC5555100100SBSC07GTCCCGACGA6666100100SBSC08TGGACCGGTG4646100100合計(jì)4753445193.6196.23

表32個(gè)鯉魚群體多樣性指數(shù)

群體Shannon信息指數(shù)Neis基因多樣性響水河0.479 9 0.328 7草壩0.455 7 0.298 4總的0.515 50.341 7

2.3群體間的遺傳變異分析

根據(jù)總的基因多樣性（Ht）和群體內(nèi)基因多樣性（Hs）可以推算出群體間分化水平（Gst）。本研究的2個(gè)鯉魚群體間的遺傳分化系數(shù)Gst為0.082 4，即群體間的遺傳變異占總遺傳變異的8.24%，群體內(nèi)的遺傳變異占總變異的91.76%，顯示出2個(gè)群體間不存在明顯的遺傳變異（表4）。

表42個(gè)鯉魚群體遺傳分化與基因流

指標(biāo)總的基因多

樣性（Ht）群體內(nèi)基因

多樣性（Hs）遺傳分化

系數(shù)（Gst） 基因流

（Nm）平均 0.341 70.313 5 0.082 4 5.569 0標(biāo)準(zhǔn)差 0.015 60.014 9

2.4群體間的遺傳關(guān)系分析

依據(jù)10個(gè)有效引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，計(jì)算出2種鯉魚群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離如表5所示。響水河和草壩2個(gè)群體的遺傳相似性系數(shù)為0.958 1，遺傳距離為0.041 9。

表52個(gè)鯉魚群體間的相似性（右上角）和遺傳距離（左下角）

群體 響水河草壩響水河 ****0.958 1草壩0.041 9 ****

3討論

3.12個(gè)鯉魚群體的遺傳多樣性

RAPD標(biāo)記操作簡(jiǎn)單、方便、快速并且引物具有隨機(jī)性[8-9]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的遺傳多樣性研究，如張濤等對(duì)漢江上游鯽魚研究其多態(tài)位點(diǎn)比例為67.77%[10]；方耀林等對(duì)長(zhǎng)江水系的3個(gè)青魚群體進(jìn)行研究，結(jié)果表明多態(tài)性位點(diǎn)比例為75%[11]；勵(lì)迪平等報(bào)道曼氏無針烏賊的多態(tài)性位點(diǎn)比例為14.6%，平均雜合度Ho為0.032[12]，所得出的曼氏無針烏賊的遺傳多樣性是比較低的；朱學(xué)峰研究發(fā)現(xiàn)廣西中華草龜?shù)亩鄳B(tài)位點(diǎn)比例為66.29%，廣西中華草龜?shù)倪z傳多樣性比較豐富，但是個(gè)體間的親緣關(guān)系比較近，遺傳變異程度很小[13]；張偉等對(duì)東南太平洋智利竹魚研究發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)比例為98.08%，Neis基因多樣性指數(shù)為0.350 0±0144 0，群體的Shannon信息指數(shù)為0.520 2±0.181 3，遺傳分化指數(shù)Gst為0.031 1，結(jié)果表明該海域智利竹魚群體的遺傳多態(tài)性比較高，但群體間不存在明顯的遺傳分化[14]；張學(xué)明等研究發(fā)現(xiàn)北海文昌魚Shannon信息指數(shù)為 0.219 0[15]。本試驗(yàn)篩選出10條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用RAPD技術(shù)對(duì)響水河和草壩鯉魚群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，表明2個(gè)群體的平均多態(tài)位點(diǎn)比例分別為93.61%和9623%，Shannon信息指數(shù)分別為0.479 9 、0.455 7，表明響水河和草壩2個(gè)鯉魚群體遺傳多樣性比長(zhǎng)江銅魚、武漢市場(chǎng)購(gòu)回的普通鯽魚、漢江上游鯽魚、長(zhǎng)江水系青魚、曼氏無針烏賊、廣西中華龜?shù)倪z傳多樣性豐富，但沒有東南太平洋智利竹魚遺傳多樣性豐富。

3.22個(gè)鯉魚群體之間的遺傳差異

Thorpe研究認(rèn)為，同種不同群體間遺傳距離D在0.03～0.2之間，遺傳相似度（I）在0.80～0.97之間，不同物種間遺傳相似度（I）在0.2～0.8之間[16]。本研究中，2個(gè)鯉魚群體間的基因分化系數(shù)Gst為0.082 4，表明8.24%的遺傳變異來自于群體間，群體內(nèi)的遺傳變異占總變異的91.76%，這說明這2個(gè)區(qū)域群體之間不存在顯著的遺傳分化，但不同群體間存在一定的遺傳分化。響水河和草壩2個(gè)鯉魚群體的遺傳相似度較高（0.958 1），遺傳距離D為0.042 9，大于0.03小于0.2，表明2個(gè)群體間存在一定的遺傳分化。本研究獲得的遺傳多樣性數(shù)據(jù)可以對(duì)今后紅河州鯉魚遺傳變異水平及其變化趨勢(shì)分析提供參考。

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