楊瑪麗， 趙統(tǒng)敏， 余文貴， 張保龍， 陳天子， 趙麗萍， 王銀磊

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，江蘇 南京210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術研究所，江蘇 南京210014)

RNAi(RNA interference)是在20 世紀90 年代被發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA(Double strained RNA，dsRNA)誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達，在進化過程中是高度保守的［1］。RNAi 具有4 個重要特征:高特異性、抑制基因表達的高效性、RNAi 的可擴散性和可遺傳性以及沉默信號的高穩(wěn)定性［2-4］。因此，RNA干擾現(xiàn)象自從被發(fā)現(xiàn)以后，迅速成為當今生物學研究的一大熱點。利用RNAi 技術，能夠擴大可操作基因的范圍和突變的種類，對目的基因的表達具有可控性，為RNAi 在植物功能基因組學研究以及植物性狀改良方面提供了一個強有力的手段［5］。而番茄是世界范圍內(nèi)的重要經(jīng)濟作物，同時在植物生物學研究領域也占有重要地位，因此RNAi 技術在番茄應用中的研究比其他蔬菜作物更廣泛、更深入，并率先在品質(zhì)及抗病性改良方面取得了成功。為此，本研究對RNAi 在番茄基因功能、品質(zhì)改良、抗病研究中的應用進行了綜述。

1 RNAi 在番茄基因功能分析方面的應用

隨著后基因組時代的到來，植物功能基因組學已成為生物學研究的熱點。高通量測序技術的成熟使得植物核酸序列信息與日劇增，針對目的基因構建siRNA，利用RNAi 技術關閉該基因的表達，根據(jù)表型的改變可以分析基因的功能，因此RNAi 為大規(guī)模功能基因組學的研究提供了切實可行的方法，在番茄發(fā)育相關基因功能研究中也得到了廣泛的應用。

1.1 番茄營養(yǎng)器官發(fā)育

張建苓［6］構建了SlDEAH1 基因的沉默表達載體，發(fā)現(xiàn)轉基因番茄葉片長度明顯短于野生型番茄葉片，葉片大小也明顯小于野生型番茄葉片，表明該基因在番茄葉片發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Xiao等［7］利用RNA 干涉技術分別調(diào)控了GA 20-氧化酶的3 個家族成員的表達，結果發(fā)現(xiàn)，GA20ox1 和GA20ox2 RNAi 轉基因植株表現(xiàn)半矮化，葉片變小增厚，葉色加深，而GA20ox3 RNAi 轉基因植株側根數(shù)量減少，長度增加，3 個GA20ox 的RNAi 轉基因植株均能正常開花結果，形成正常的種子，說明抑制GA20oxd 表達對植物營養(yǎng)器官的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，而對生殖器官的發(fā)育影響不大。

1.2 番茄生殖器官發(fā)育

王翔等［8］利用RNAi 技術顯著降低了轉基因植株中TAG1 的轉錄水平，發(fā)現(xiàn)該基因不僅嚴重影響番茄雄蕊和雌蕊的形態(tài)，還影響果實的育性。Vrebalov 等［9］利用RNAi 技術，證明了番茄TAGL1 基因能夠調(diào)控番茄肉質(zhì)果實膨大及成熟。Dong 等［10］以MADS-box 轉錄因子SlMADS1 為靶基因構建了RNAi 載體，轉基因植株的番茄果實成熟時間縮短，乙烯產(chǎn)量相比對照植株的果實也增長了2 ～4 倍，由此證明SlMADS1 作為負調(diào)控因子參與番茄果實成熟。De 等［11］針對生長素響應因子ARF7 構建RNAi載體抑制其表達，轉基因植株獲得了無籽果實，為生長素調(diào)控植物的單性結實提供了直接證據(jù)。

近年來番茄基因組測序的完成，人們獲得了眾多的候選基因，RNAi 為注釋和認識這些基因作用提供了一種快速、高效的鑒定方法，今后越來越多的基因功能將得以確定。

2 RNAi 在番茄品質(zhì)遺傳改良方面的應用

番茄因其豐富的營養(yǎng)、獨特的風味和多樣的食用方式而深受人們喜愛。隨著人民生活水平和生活質(zhì)量的提高，番茄品質(zhì)受到越來越多的關注。RNAi 技術對目的基因的操作具有可控性，不僅可以縮短育種周期，而且可以特定的改變農(nóng)產(chǎn)品的某些品質(zhì)。因此，利用RNAi 技術提升番茄品質(zhì)已成為番茄品質(zhì)育種的主要研究方向之一，主要用于提高番茄紅素和維生素C 含量及提高番茄耐貯性等方面的研究。

2.1 RNAi 與番茄紅素積累

番茄紅素的抗氧化性能是天然類胡蘿卜素中最強的，而且在保護人類健康方面起著非常重要的作用［12-14］。隨著番茄紅素生物合成途徑的闡明以及RNAi 技術的不斷發(fā)展，在提高番茄果實中番茄紅素含量方面的研究不僅僅局限于促進番茄紅素生物合成酶(PSY、PDS、ZDS)的超量表達，應用RNAi 技術可介導抑制植物基因的表達，從而達到調(diào)控基因的目的。

研究結果表明，番茄果實中的光敏色素對果實成熟過程中番茄紅素積累具有調(diào)節(jié)作用［15］。Liu等［16］利用RNAi 技術，對光信號傳導基因LeHY5 和LeCOP1LIKE 進行調(diào)控，可以大幅度改變番茄果實的色素積累和營養(yǎng)品質(zhì)。Davuluri 等［17］利用RNAi 技術，結合使用果實特異性啟動子，選擇性抑制了果實中的DET1 基因的活性，得到的轉基因番茄果實中番茄紅素的含量提高了4 倍，且對產(chǎn)量及品質(zhì)未產(chǎn)生不良影響。萬群等［18］通過RNAi 抑制編碼番茄紅素轉化酶基因Lcy 的表達，并結合果實特異性啟動子Pds，得到的轉基因番茄果實中番茄紅素的平均含量是對照的2.1 倍，最高可增長3.2 倍。馬超等［19］通過RNAi 阻斷番茄紅素β 環(huán)化酶基因Lyc-β來達到調(diào)控番茄紅素大量積累的結果，轉基因植株中番茄紅素的含量最高可達13.84 μg/g，F(xiàn)W，是對照的4.26 倍。最近，Sun 等［20］利用RNAi 技術將編碼9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素加雙氧酶蛋白質(zhì)基因SlNCED1 進行了沉默，轉基因植株果實的番茄紅素和β-胡羅卜素均得到了顯著增加。

2.2 RNAi 與番茄耐貯性改良

番茄是呼吸躍變型的果實，不耐貯藏和運輸，果實成熟后極易變質(zhì)腐爛。利用RNAi 技術提高果實耐貯性時，主要是通過兩種途徑延長番茄的存貯期。

第1 種途徑是通過抑制乙烯的產(chǎn)生，主要選擇與乙烯合成有關的SAM(S-adenosine ammonium sulfate acid)水解酶基因、ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)合成酶基因、ACC 氧化酶基因、ACC脫氫氨酶基因，從而達到果實耐貯的目的。Xiong等［21］根據(jù)ACC 氧化酶基因的序列構建RNAi 載體，農(nóng)桿菌介導法進行遺傳轉化，結果發(fā)現(xiàn)13%的植株沒有表現(xiàn)出RNA 干擾效果，18% 的植株表現(xiàn)出50%的RNA 干擾效果，果實從破色期到成熟期需要30 d，69%的轉化植株表現(xiàn)出100%的RNA 干擾效果，果實從破色期到成熟期需要120 d，而對照果實只需5 d。Chen 等［22］用BP 克隆的方法構建了番茄ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase)基因的RNAi 載體，獲得轉基因植株27 株，內(nèi)源ACO 基因的表達均得到了抑制，所有轉基因植株的乙烯生產(chǎn)量明顯低于對照植株。Gupta 等［23］利用RNAi 技術，并結合果實特異性啟動子2A11 抑制了3 個ACS(1-aminocycloppropane-l-carboxlic acid synthase)基因(ACS6、ACS1A、ACS2)的表達，轉基因植株果實從破色期到成熟期延長至45 d，而對照果實收貨后8 ～10 d 即開始腐爛。

第2 種途徑是通過抑制細胞壁果膠的降解，主要是選擇與細胞壁水解有關基因作為靶基因使其沉默。甘露聚糖酶通過參與細胞壁降解在番茄成熟過程中發(fā)揮重要作用，Wang 等［24］利用mRNAi 技術抑制了LeMan4a 基因的表達，從而抑制了甘露聚糖酶的活性，轉基因植株果實的硬度明顯比對照要高。Meli 等［25］選擇了與果實成熟過程中特有的N 糖蛋白質(zhì)修飾酶中α-Man 和β-Hex 基因，分別構建了RNAi 載體，結果發(fā)現(xiàn)，含有α-Man-RNAi 的轉基因植株的果實硬度是對照的2.5 倍，含有β-Hex-RNAi的轉基因植株的果實硬度是對照的2 倍，二者的貨架期均延長了大約30 d，而且未對包括產(chǎn)量在內(nèi)的其他表型性狀產(chǎn)生負面影響。

由此可見，RNAi 技術能非常有效地抑制靶基因的表達，是改良番茄耐貯性的有效手段。

2.3 RNAi 與番茄維生素C 改良

番茄中含有豐富的抗壞血酸(即維生素C)，通過基因工程手段調(diào)控植物抗壞血酸合成和代謝，能夠增加其產(chǎn)品的營養(yǎng)品質(zhì)，并增強植物本身對逆境的抗性。抗壞血酸過氧化酶(APX)和抗壞血酸氧化酶(AAO)是植物抗壞血酸的氧化代謝途徑中的關鍵酶。

Zhang 等［26］利用RNAi 技術減少了線粒體抗壞血酸過氧化物酶mitAPX 基因的表達，相比對照植株，轉基因植株中mitAPX 活性減少了29% ～45%，而抗壞血酸的含量增加了1.4 ～2.2 倍，從而為提高植物抗壞血酸含量提供了一種切實可行的的方法。

3 RNAi 在番茄抗病方面的應用

3.1 抗病毒病

植物病毒病是重要的植物病害，應用RNAi 技術可以實現(xiàn)對病毒的有效防治。把源自病毒的基因構建成反向重復結構導入植物體，植物會通過RNAi 機制對病毒轉錄的mRNA 進行切割降解，從而阻止病毒的復制擴張，進而保護植物體不受病毒危害［27］。

番茄黃化曲葉病毒病是一種在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行的毀滅性病害，危害嚴重的地區(qū)可導致番茄的全面絕產(chǎn)，已經(jīng)成為世界許多地區(qū)番茄生產(chǎn)上的重要限制因素［28-29］。引起該病害的番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)為單鏈DNA 病毒，具有6 個開放性閱讀框，分別編碼外殼蛋白質(zhì)(CP)、移動蛋白質(zhì)(V2)、復制相關蛋白質(zhì)(Rep)、轉錄激活蛋白質(zhì)(TrAP)和復制加強蛋白質(zhì)(REn)［30］。以V1 基因為靶基因構建siRNAs，利用GFP 作為報告基因，轉入micro-tom 番茄中干擾了CP 積累，經(jīng)過煙粉虱接種鑒定，轉基因植株49 d后沒有表現(xiàn)出癥狀，而對照植株接種14 d 后就表現(xiàn)出癥狀［31］。以C1 基因的3'端的726 個核苷酸序列形成的發(fā)夾結構轉入到感病番茄材料Campbell-28中，用來誘導轉錄后的基因沉默以抑制TYLCV 的復制，得到的轉基因番茄植株對TYLCV 表現(xiàn)出了較好的抗性［32］。將Rep 蛋白質(zhì)基因的5'端部分序列與IR序列相連導入番茄，轉基因番茄植株在被TYLCV 侵染后無病癥產(chǎn)生，而且通過PCR 也未檢測到病毒DNA［33］。同時，有研究選用了TYLCV 中開放閱讀框之間的3 個重疊片段C1C2、C2C3、V1V2 分別構建了RNAi 載體，獲得的轉基因番茄利用TYLCV-Eg 侵染性克隆過量接種10 d，結果發(fā)現(xiàn)含有C1C2 載體的轉基因植株抑制病毒的復制的效果最為理想［34］。可見通過RNAi 技術可以干擾TYLCV 的功能基因，阻止病毒功能基因的合成，從而阻礙病毒的合成、組裝和復制，達到抗病毒的作用。

番茄花葉病毒(ToMV)是一類世界性分布的植物病毒，侵染番茄后，會使葉片出現(xiàn)黃綠相間、濃淡不均，對番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量影響較大。蘇建輝等［35］利用ToMV 的CP、復制酶區(qū)基因片段，構建RNAi 載體，結果發(fā)現(xiàn)當野生型加工番茄出現(xiàn)系統(tǒng)侵染并嚴重矮化或植株枯死時，轉基因植株一直沒有發(fā)病現(xiàn)象，RT-PCR 也沒有檢測到ToMV 病毒。

馬鈴薯Y 病毒(PVY)主要感染馬鈴薯、番茄、辣椒等作物，感染該病毒一般減產(chǎn)50%左右。有研究結果表明eIF4E 參與植物病毒互作，影響病毒在寄主中復制和侵染過程。張余洋等［36］通過RNA 干涉調(diào)控番茄elF4E 表達，結果發(fā)現(xiàn)轉化番茄對PVY表現(xiàn)較好的抗性，因此通過RNAi 技術抑制elF4E表達可提高植物對PVY 的抗性。

3.2 抗真菌病

番茄容易受到真菌性病害的侵染。有研究結果表明，在病原菌與植物的互作過程中，植物體內(nèi)的雙鏈干涉序列是可以進入到病原菌體內(nèi)，盡管進入的機制還不十分清楚［37］。針對病原菌的致病關鍵基因構建干擾載體，并轉化到寄主細胞中，通過病原菌與寄主的互作，RNAi 產(chǎn)物能夠進入到病原菌體內(nèi)，從而抑制了致病關鍵基因的表達，使病原菌缺乏致病力［38］。目前利用該方法在番茄抗真菌病害研究中還沒有報道。

3.3 抗根結線蟲

在全世界范圍內(nèi)，根結線蟲(Meloidogyne spp.)對很多的作物造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重阻礙農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。利用RNA 干涉技術在植物組織內(nèi)產(chǎn)生dsRNA，線蟲在取食植物細胞質(zhì)的同時也攝入了dsRNA，從而誘導相應基因的沉默，為運用轉基因技術防治根結線蟲提供了新的策略。

番茄是多種根結線蟲的高感病的寄主，利用RNAi 技術提高番茄對線蟲抗性的報道也逐漸增多。張余洋等［39］選取根結線蟲寄生相關的3 個基因作為靶基因分別構建RNAi 載體，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化得到番茄轉基因植株，結果發(fā)現(xiàn)分別干涉Mi-crt和16D10 的轉基因植株均獲得了明顯的根結線蟲抗性，從而證實利用RNAi 技術使番茄獲得對線蟲抗性的方法是可行的。Matsuraga 等［40］將南方根結線蟲POS-1 基因的dsRNA 接種到番茄根部，接著用根結線蟲侵染根部發(fā)現(xiàn)，根結線蟲的孵化率與對照組相比明顯降低。可見在植物表達與昆蟲同源的雙鏈RNA，可以觸發(fā)取食體內(nèi)發(fā)生RNA 干擾，進而影響昆蟲生長甚至殺死昆蟲，而且利用RNAi 技術防治害蟲具有很高的特異性，不會對其他有益昆蟲產(chǎn)生影響。

需要注意的是線蟲的取食管對分子的大小具有篩選的作用，如果選擇的dsRNA 片段過長，可能會超過線蟲取食管所限制的大小，而無法進入線蟲體內(nèi)。

4 展望

RNAi 已成為研究基因功能不可或缺的工具。但在利用RNAi 技術研究基因功能時，最好同步構建超表達載體進行轉化，通過正向和反向遺傳學方法來觀察某個基因在植物中的表型，相互驗證，從而確定其功能。另外，解析基因的功能必須同時考慮基因及其表達產(chǎn)物之間的廣泛聯(lián)系和相互作用網(wǎng)絡，僅僅依靠RNAi 是難于勝任的，還需要與其他技術的結合，如RNAi 與基因芯片技術的結合，以便了解被沉默基因與其他基因的關系。

RNAi 技術作為一種下調(diào)表達技術，廣泛應用于作物的遺傳改良進程中。利用RNAi 技術獲得的轉基因植株，既不存在有功能的基因或蛋白質(zhì)，也不存在轉基因mRNA 的積累，較為符合人們對生物安全性的要求。因此，隨著人們對RNAi 技術研究的不斷深入，該技術可以創(chuàng)制更多類型的新種質(zhì)，在番茄抗病性、品質(zhì)遺傳改良方面將具有更為廣泛的應用前景。

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