張自雄，胡麗梅，向峰，鄒軍根

（巴中市公安局物證鑒定所，四川巴中 636000）

·經(jīng)驗交流·

水中白骨化尸體的DNA檢驗

張自雄，胡麗梅，向峰，鄒軍根

（巴中市公安局物證鑒定所，四川巴中 636000）

法醫(yī)遺傳學(xué)；磁珠法；硅膜法；股骨；牙齒

白骨化尸體的身源鑒定往往是法醫(yī)學(xué)鑒定的難點之一。通常選用長骨、牙齒作為檢材，然而對于水中浸泡的白骨化尸體則增加了DNA檢驗的難度，如何建立穩(wěn)定、有效的檢驗方法具有重要意義。本研究就本實驗室近年來對在水中浸泡后形成的50例白骨化尸體的DNA檢驗，總結(jié)經(jīng)驗，介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

各類案件發(fā)現(xiàn)的水中白骨化尸體50例，共取得股骨50根、牙齒50枚。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理

取股骨干一段，沙紙反復(fù)擦拭去除表面污垢，5%次氯酸鈉溶液清洗表面，蒸餾水清洗3～6次，無水乙醇沖洗一次，晾干，最后紫外光照射。

取送檢牙齒，用蒸餾水浸泡清洗表面，并用棉簽、刀片等除去牙齒表層污垢，加入5%次氯酸鈉浸泡10min左右，棄廢液，蒸餾水泡洗3～5次，95%乙醇溶液浸泡1 h，用濾紙吸干，以紫外線消毒牙齒各面各15min。

1.2.2 裂解

將牙齒用簡易砸牙器砸成牙齒粉末，用電鉆鉆取股骨干部位制成骨粉，分別置于1.5mL離心管中，加入0.5mol/L脫鈣液（EDTA），振蕩后放于37℃水浴箱脫鈣24h，隔12h離心，更換EDTA。脫鈣完成后，以離心半徑5cm，13000r/min，離心5min，棄去上清液，牙齒粉末中加入300 μL骨骼裂解液、30 μL DTT溶液（1 mol/L）以及30 μL PK溶液（20 mg/μL），56℃消化12 h，消化完全后，以離心半徑5 cm，13 000 r/min，離心5min，將上清液移至新1.5mL離心管中進行純化。

1.2.3 純化

取以上上清液各一半分別采用硅膜法（QIAquick純化試劑盒，德國QIAGEN公司）和磁珠法（DNA IQ試劑盒，美國Promega公司）試劑進行DNA純化。

硅膜法純化步驟：（1）將上清液與體積相同的V氯仿/V異戊醇=24∶1混勻，以離心半徑5cm，13000r/min，離心5min，吸取上層水相至5mL試管中。（2）用純化試劑盒中的PBI試劑與上清液按5∶1體積振蕩混勻，然后向純化柱中加入適量混合液，以離心半徑5cm，13000r/min，離心1min，重復(fù)操作直到混合液全部過濾。（3）加300μL PBI試劑離心并洗滌1次，加入已配制的洗滌液（PE），離心并洗滌3次，再以離心半徑5 cm，13 000 r/min，離心1 min，將純化柱放到新的1.5mL微量離心管上，打開蓋子于室溫中揮發(fā)5min。（4）將洗脫液（EB）20 μL加入純化柱的硅膜中心，65℃恒溫5 min，以離心半徑5 cm，13 000 r/min，離心1 min，收集微量離心管內(nèi)液體用于PCR反應(yīng)或置于4℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

磁珠法純化步驟：（1）取適量液體樣品放入1.5mL離心管中，加入2倍體積配制好的裂解液（內(nèi)含1μL 1mol/L DTT）和7μL磁珠，旋渦振蕩使磁珠懸浮，室溫放置5min。（2）旋渦振蕩后將離心管放在磁架上，小心吸去液體。（3）用100μL裂解液洗滌一次，旋渦振蕩使磁珠懸浮，將離心管放在磁架上，小心吸去液體。（4）用100μL洗液洗滌3次，每次旋渦振蕩使磁珠充分懸浮。（5）打開離心管蓋，室溫下空氣干燥5～10min。（6）加入30μL的EB洗脫液，蓋好蓋子，65℃加熱5min。（7）從水浴中取出離心管，立即用旋渦振蕩器振蕩離心管，待磁珠懸浮后，立即將離心管放回磁架上。（8）小心將DNA溶液吸到干凈離心管中用于PCR擴增或置于4℃冰箱保存。

1.2.4 PCR擴增和電泳檢測

采用Identifiler試劑盒（美國AB公司）擴增，操作按照儀器及試劑使用說明書進行。

擴增后用3130XL遺傳分析儀（美國AB公司）進行電泳檢測，GeneMapper v3.2軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

在50例送檢檢材中，對股骨采用硅膜法純化獲得STR分型46例，采用磁珠法純化獲得STR分型42例。牙齒采用硅膜法純化獲得STR分型50例，采用磁珠法純化獲得STR分型47例。經(jīng)與失蹤人員親屬DNA STR分型比對，均符合生物學(xué)遺傳關(guān)系。

通過對水中白骨化尸體長骨、牙齒的DNA檢驗，筆者認(rèn)為牙齒DNA檢驗效果優(yōu)于長骨。雖然牙齒和長骨內(nèi)的DNA分子保存均較長，但是牙齒有3種堅硬的礦化組織保護，因此對于時間和外界環(huán)境（如水）有較強抵抗力，而長骨正是缺少這樣一種特殊的保護，其DNA分子往往受到破壞而降解。因此條件允許的情況下，對于白骨化尸體，DNA檢驗時選擇牙齒檢材要優(yōu)于長骨。同時選擇的牙齒要保證其完整性，優(yōu)先選擇磨牙。在選擇純化試劑盒的方面，本實驗室在純化過程中分別采用了磁珠純化法和硅膜純化法進行結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)硅膜法純化法優(yōu)于磁珠純化法，分析其原因可能為硅膜可通過控制孔徑選擇性地濾過DNA分子，達到最佳純化目的。

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.017

1004-5619（2015）02-0147-01

2014-09-24）

（本文編輯：李成濤）

張自雄（1979—），男，四川巴中人，主檢法醫(yī)師，主

要從事法醫(yī)物證學(xué)檢驗工作；E-mail：37788913＠qq.com