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        Chelex-100法和QIAcube純化法在接觸性檢材檢驗中的比較

        2015-12-23 07:21:46廖長青成靜劉維
        法醫(yī)學雜志 2015年2期

        廖長青,成靜,劉維

        (湘潭市公安局刑科所,湖南湘潭 411100)

        Chelex-100法和QIAcube純化法在接觸性檢材檢驗中的比較

        廖長青,成靜,劉維

        (湘潭市公安局刑科所,湖南湘潭 411100)

        法醫(yī)遺傳學;Chelex-100法;QIAcube純化法

        在法醫(yī)DNA檢驗中,能否提取到足夠濃度與純度的DNA模板,是決定DNA檢驗成敗的關鍵之一。本研究分別采用Chelex-100法與QIAamp DNA Investigator試劑盒結合QIAcube核酸自動化提取儀(QIAcube純化法)提取實際檢案中的DNA,同等條件下進行PCR擴增與電泳,比較分析二者的圖譜,報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        65份接觸性生物檢材來自本實驗室日常檢案積累,其中瓶口32份,工具手柄18份,繩索衣物類15份。瓶口和工具手柄檢材均采用生物物證提取專用棉簽(公安部物證鑒定中心)干濕兩步法提取;繩索衣物類檢材采用脫落細胞粘取器(公安部物證鑒定中心)粘附提取。

        1.2 DNA提取

        1.2.1 Chelex-100法

        取檢材適量,剪碎后放入0.5mL離心管中,加入適量Chelex-100懸濁液與蛋白酶K溶液,恒溫搖勻孵育儀(珠海博邁杰公司)上56℃孵育1.5h,煮沸10min,離心取上清液適量擴增。

        1.2.2 QIAcube純化法

        取檢材適量,剪碎后放入0.5mL離心管中,加入QIAamp DNA Investigator試劑盒(德國QIAGEN公司)中ATL裂解液300μL及蛋白酶K 20μL,恒溫搖勻孵育儀上56℃孵育1.5 h,再使用試劑盒提供的MinElute離心柱在QIAcube核酸自動化提取儀(德國QIAGEN公司)上純化提取DNA,洗脫體積30μL,取洗脫液適量擴增。

        1.3 PCR擴增與STR分型

        使用AmpFLSTR?Identifiler?Plus試劑盒(美國AB公司)在9700型PCR擴增儀(美國AB公司)上擴增,反應體系10 μL,循環(huán)30次。擴增產物在3130XL遺傳分析儀(美國AB公司)上電泳檢測,使用GeneMapper ID v3.2.1分析數(shù)據,圖譜峰高識別閾值為50RFU。

        2 結果

        對上述檢驗圖譜進行統(tǒng)計,可以看出兩種提取方法的提取產物經同樣的擴增、檢測,QIAcube純化法所得結果要明顯優(yōu)于普通的Chelex-100法。按等位基因檢出數(shù)的不同,統(tǒng)計結果見表1。

        表1 兩種提取方法的STR分型結果(等位基因檢出數(shù))[例(%)]

        瓶口檢材無論采用Chelex-100法還是QIAcube純化法均有較高的檢出率,尤其是使用QIAcube純化法時有90.63%的檢材可檢出9個以上等位基因,且峰高基本在1000RFU以上,多為單一來源,僅有2例混合斑。未檢出的3例均無瓶蓋保護,推測DNA降解毀損嚴重。

        工具手柄擦拭子與繩索衣物類檢材使用Chelex-100法提取,檢出率均不高,尤其是繩索衣物類檢材使用脫落細胞粘取器粘取后直接用Chelex-100法提取時僅13.33%的檢材可檢出9個以上等位基因。使用QIAcube純化法提取,兩者的檢出率均有明顯提高,但峰高基本在2000RFU以下,而且來源復雜,多檢出混合基因圖譜。

        3 討論

        Chelex-100是一種由苯乙烯和二乙烯基苯共聚體組成的化學螯合樹脂,可以螯合多價金屬離子,尤其是選擇性螯合二價離子(如鎂離子),使體系中降解DNA的核酸酶失活,從而保護DNA分子。Chelex-100法提取DNA,在同一管中操作,因此檢材的損失率低,相對不容易污染,操作簡便快速,價格低廉,對試劑設備的要求低,廣泛適用于常規(guī)物證的DNA提取[1]。楊電等[2]用小體積Chelex-100法提取微量口腔脫落細胞檢材DNA進行STR分型,9個以上STR位點分型成功率在60%左右,與筆者使用Chelex-100法提取瓶口56.25%的成功率相當。但此方法將DNA檢材的載體、核膜及其他試劑一起保留在同一離心管中,不能有效去除雜質,降低了DNA的純度,可能抑制下游的PCR擴增,從而導致檢出率下降。暢晶晶等[3]分別采用6種不同的方法提取全血DNA,通過試驗證明常規(guī)Chelex-100法所得DNA模板的純度較低。因此Chelex-100法通常只適用于污染輕、雜質少、DNA含量高、載體體積小的常規(guī)檢材的DNA提取,而在污染、腐敗、微量檢材的處理上存在很大的局限性。如筆者使用該方法處理工具手柄及繩索衣物類檢材時,檢出率較低,分別為33.33%、13.33%,明顯低于QIAcube純化法的72.22%、80.00%。

        QIAamp DNA Investigator試劑盒使用的MinE-lute離心柱,上面的硅膠膜既能與DNA硅膠膜特異性結合,又能濾去大顆粒雜質與可溶性PCR抵制物,最后使用小體積ATE緩沖液洗脫,得到不含蛋白質、核酸酶和抑制劑的DNA濃縮液,有利于下游的PCR擴增。QIAcube核酸自動化提取儀將上述裂解、結合、清洗、洗脫操作流程實現(xiàn)標準化、封閉化、全自動化,避免人為操作帶來的誤差、污染等問題,使DNA檢驗快速、準確、可重復。從DNA提取的原理來看,QIAcube純化法能更有效地釋放DNA,而且可以有效去除模板DNA中的雜質,同時兼具濃縮富集功能,因而可以獲得更純、濃度更高的DNA模板。從實際檢驗效果來看,使用該方法提取DNA不僅檢出率明顯高于Chelex-100法,而且其圖譜峰高也明顯高于Chelex-100法。此外,對于純化過的微量DNA樣本,通常使用小體系平行擴增同時適當增加循環(huán)次數(shù)來提高其檢測的靈敏度[4],但同時也會伴隨著等位基因插入、等位基因丟失、stutter產物增加等問題,需要謹慎判別圖譜。

        [1]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析[M].北京:中國人民公安大學出版社,2002:38-39.

        [2]楊電,劉超,徐曲毅,等.微量口腔脫落細胞檢材的DNA檢驗[J].法醫(yī)學雜志,2008,24(2):126-128.

        [3]暢晶晶,張素華,李莉.全血中DNA 6種提取方法的比較[J].法醫(yī)學雜志,2009,25(2):109-111,114.

        [4]張璐,王保捷,丁梅,等.循環(huán)次數(shù)與體系對DNA檢測靈敏度的影響[J].法醫(yī)學雜志,2013,29(2):125-126.

        DF795.2

        B

        10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.018

        1004-5619(2015)02-0148-02

        2013-12-18)

        (本文編輯:李成濤)

        廖長青(1982—),男,湖南懷化人,主檢法醫(yī)師,主要從事法醫(yī)物證檢驗及鑒定工作;E-mail:35046786@qq.com

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