楊成超

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115200)

楊樹營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

楊成超

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115200)

楊樹是研究樹木分子生物學(xué)的模式樹種，營養(yǎng)生長是人們在木材利用時的重點(diǎn)關(guān)注對象，轉(zhuǎn)基因是楊樹遺傳育種的重要手段之一。文章綜述了楊樹營養(yǎng)生長方面的轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展，包括初生生長、形成層、木質(zhì)素、光合作用和植物激素5個方面，還探討了研究中存在的問題，并對以后的發(fā)展做了展望。

楊樹；營養(yǎng)生長；轉(zhuǎn)基因；進(jìn)展

楊樹(Populus)是重要的綠化和用材樹種，也是樹木分子生物學(xué)研究的模式樹種。楊樹的營養(yǎng)生長主要指初生生長和次生生長，包括根、莖、葉整個生長過程。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。基因工程、遺傳轉(zhuǎn)化和遺傳工程都是轉(zhuǎn)基因的同義詞?；蚬こ逃N是楊樹遺傳育種的重要的手段，自二十世紀(jì)九十年代以來，中國楊樹轉(zhuǎn)基因研究在抗蟲、抗病、耐鹽堿基因工程方面取得較大成績[1,2]，但在營養(yǎng)生長的轉(zhuǎn)基因方面鮮有總結(jié)。本文旨在總結(jié)楊樹營養(yǎng)生長基因轉(zhuǎn)化的研究情況，為提高楊樹產(chǎn)量和改善木材品質(zhì)打下基礎(chǔ)。

1 與初生生長有關(guān)的基因轉(zhuǎn)化

Tzfira[3]等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將rol基因?qū)霘W洲山楊的嫩莖，研究了莖干生長、葉芽萌發(fā)和分枝習(xí)性。研究表明：轉(zhuǎn)rol基因植株表現(xiàn)為頂端優(yōu)勢被打破，每個外植體產(chǎn)生多達(dá)4個腋芽，累積莖干長度較大和生長速率較快，莖干生長指數(shù)增加。Nilsson 等[4]的研究表明, 轉(zhuǎn)rolA 或B或C 基因的雜種楊樹生長和發(fā)育速度、生根能力均發(fā)生改變。其中轉(zhuǎn)rolC 基因的楊樹不僅表型發(fā)生改變(如頂端優(yōu)勢降低、植株矮化和節(jié)間縮短), 同時植物內(nèi)源激素含量下降、赤霉素合成發(fā)生變化, 而細(xì)胞分裂素水平卻升高。轉(zhuǎn)基因植株的矮化可能是細(xì)胞數(shù)的減少所導(dǎo)致的。Claudia等[5]研究了3年生的轉(zhuǎn)rolC基因歐洲山楊×美洲山楊的木材形成及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。該轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的莖生長減少和芽萌發(fā)提前等特點(diǎn)，芽萌發(fā)和葉片形成后并不立即開始形成木材，而對照卻開始形成木材；轉(zhuǎn)基因楊樹和對照的木材結(jié)構(gòu)沒有明顯的區(qū)別，轉(zhuǎn)rolC基因的楊樹可以作為研究木材形成機(jī)制的一種有用的模式。

張冰玉等[6]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將透明顫菌血紅蛋白 Vitreoscilla hemoglobin (VHb)基因vgb導(dǎo)入銀腺楊。共獲得52株整合了vgb基因的再生植株。在溫室生長條件下，轉(zhuǎn)基因無性系的外部形態(tài)與對照相比無顯著差異。但在株高和地徑上，有3株轉(zhuǎn)基因無性系較對照植株有明顯增加。王建革等還把vgb轉(zhuǎn)入安托楊，也獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

2 與形成層形成有關(guān)的基因轉(zhuǎn)化

調(diào)節(jié)頂芽分生組織的一些重要基因家系也在形成層中表達(dá)。例如KANADI轉(zhuǎn)錄因子和HD-ZIP Ⅲ 基因在歐洲山楊(PopulustremulaL.)的形成層區(qū)域表達(dá)[7]，表明形成層與頂芽分生組織在遺傳調(diào)控上具有重疊性。Busov[8]及其同事利用激活標(biāo)簽(activation tagging)法進(jìn)行了楊樹基因轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了大量的轉(zhuǎn)基因個體，其中有9株有明顯表型變異，其中一株對應(yīng)的突變基因為赤霉酸2-氧化酶類似物。另外，增強(qiáng)子捕獲(enhancer trap)、基因捕獲(gene trap)、T-DNA插入和Ac/Ds轉(zhuǎn)座子等轉(zhuǎn)基因技術(shù)也正準(zhǔn)備用于鑒定楊樹木材形成組織中基因的具體功能。

3 與木質(zhì)素有關(guān)的基因轉(zhuǎn)化

Franke等[9]認(rèn)為林木中過量表達(dá)F5H是對木質(zhì)素生物合成進(jìn)行修飾的有效代謝基因工程策略。Jouanin等[10]通過轉(zhuǎn)COMT基因，6月齡的轉(zhuǎn)基因歐洲山楊×銀白楊的木質(zhì)素含量下降17%，木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)得到顯著改變，幾乎沒有紫丁香基型木質(zhì)素，纖維素含量提高，使木質(zhì)素更容易被工業(yè)降解。Hu等[11]通過對美洲山楊轉(zhuǎn)Pt4CL1基因的研究表明：由于對Pt4CL1基因進(jìn)行反義控制，生長10個月的轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素減少45%，纖維素增加15%，葉、根和莖生長加快，木質(zhì)素和纖維素的沉積為一種補(bǔ)償性調(diào)控模式。至今，已將4CL、CAD和豆科植物的陽離子過氧化酶基因(Shpx6a)反義導(dǎo)入美洲山楊、歐洲山楊和歐洲山楊×銀白楊(P.tremulaL.×P.albaL.)。4CL表達(dá)被抑制的轉(zhuǎn)基因美洲山楊木質(zhì)素含量也明顯下降，木質(zhì)素下降最高達(dá)45%，同時纖維素含量增加15%。Zeliha等[12]將Shpx6a轉(zhuǎn)入歐洲山楊，使轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素的含量降低10%～20%。Jouanin[10]發(fā)現(xiàn)由于基因沉默使得再生楊樹苗中35S啟動子作用的COMT活性降低為零，木質(zhì)素含量降低17%，而CAD啟動子作用下的COMT轉(zhuǎn)基因楊樹苗的纖維素含量增加，木質(zhì)素縮合程度也提高，更加不利于紙漿加工。李春秀等[13]將從毛白楊中克隆到的毛白楊纖維素合成酶基因(PtoCesA1)，轉(zhuǎn)移到煙草中。

4 與光合作用有關(guān)的基因轉(zhuǎn)化

楊樹是C3植物，對楊樹光合方面的研究一般僅僅限于光合速率、葉綠素含量等生理指標(biāo)的測定，在育種上一般只是研究不同品種間光合速率、葉綠素含量的比較分析，如羅青紅等[14]在胡楊、灰葉胡楊光合及葉綠素?zé)晒馓匦苑矫孢M(jìn)行了研究。Gallardo[15]將針葉樹GS基因?qū)霔顦?，由于GS在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)過量表達(dá)，引起谷氨酸胺合成大量增加，植物的可溶性總蛋白及葉綠素含量也相應(yīng)增加。與對照植物相比，轉(zhuǎn)基因幼苗的株高在2個月內(nèi)增加了76.0%，6個月增加了21.3%。

在高光效育種[16]方面，還沒有見到利用C4光合途徑改造楊樹的報道。C4光合途徑[17]主要涉及3種關(guān)鍵酶，即PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)、磷酸丙酮酸二激酶(PPDK)和依賴于NAD(P)的蘋果酸酶[NAD(P)-dependent malic enzyme, NAD(P)-ME]。玉米的PEPC有C4型、C3型和根型等3種類型，高粱的PEPC基因家族也有3個成員。以后，研究人員可以嘗試將PEPC等基因轉(zhuǎn)入楊樹中提高楊樹的光合速率。

5 與植物激素有關(guān)的基因轉(zhuǎn)化

五大類植物激素幾乎都參與了木質(zhì)部分化的控制，但目前對于生長素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)木質(zhì)部分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還不清楚。生長素的一個效應(yīng)因子MP可能參與了這一途徑，因為MP基因突變體導(dǎo)致了木質(zhì)部長軸分化的偏離[18,19]。山楊轉(zhuǎn)錄因子PttHB1[20]可能在木質(zhì)部分化過程中起作用。轉(zhuǎn)IAA合成酶基因白楊中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的IAA濃度比野生型稍高。然而，轉(zhuǎn)基因植物的莖的直徑比野生型植物小，且主要是木質(zhì)部徑向?qū)挾鹊臏p小造成的[21]。這一試驗結(jié)果說明采用改變激素水平的方法來改變木材材性，不能獲得理想的效果。Eriksson等[22]通過轉(zhuǎn)基因使歐洲山楊×美洲山楊中的GA過量表達(dá)，提高了生長速率和生物產(chǎn)量。赤霉素和生長素同時施用能夠促進(jìn)分生組織的活性及木質(zhì)部纖維細(xì)胞的伸長，因而赤霉素是細(xì)胞縱向伸長所必需的。超量表達(dá)GA-20氧化酶的轉(zhuǎn)基因雜種白楊縱向生長和徑向生長都有所增加，同時木質(zhì)部纖維的長度也有所增加。

6 存在問題與展望

我國的楊樹基因工程育種取得較大成績，培養(yǎng)出了抗蟲楊等一批進(jìn)入田間釋放階段的品種，但也存在一些問題。主要表現(xiàn)在具有自主知識產(chǎn)權(quán)的目的基因缺乏，速生黑楊派遺傳轉(zhuǎn)化體系尚待優(yōu)化，楊樹轉(zhuǎn)基因生物安全問題缺乏深入研究，轉(zhuǎn)基因楊樹推廣還需廣大林農(nóng)的認(rèn)可等。另外，由于樹木基因轉(zhuǎn)化后其所產(chǎn)生木材材性表型在多年之后才能被觀察到，因此，在楊樹材性方面的轉(zhuǎn)基因研究往往會受到時間的限制。

自1983年轉(zhuǎn)基因煙草問世以來，植物基因工程得到了快速發(fā)展。但樹木基因工程研究相對滯后。楊樹生長快、易繁殖、分布廣泛、易加工，受到人們的廣泛重視。提高楊樹的生長速率，改良它的木材性狀是楊樹育種的重要目標(biāo)。楊樹基因組較小，已測序(http://genome.Jgi-psf.Org/2005-9-27/)，組織培養(yǎng)體系較容易建立，與其他樹種相比，在基因工程育種方面具有較大優(yōu)勢，發(fā)展前景廣闊。

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1005-5215(2015)01-0067-03

2014-10-10

遼寧省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(2012212001)；遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金(2013002009)

楊成超(1975-)，男，遼寧黑山人，博士，高級工程師，現(xiàn)從事楊樹凍害生理和分子生物學(xué)研究.

S792.11

A

10.13601/j.issn.1005-5215.2015.01.023