于新友，李天芝，唐 娜，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

豬瘟脾淋毒活疫苗中兔瘟外源病毒檢測方法的建立及應(yīng)用

于新友1，李天芝1，唐 娜2，沈志強(qiáng)1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

為檢測商品化豬瘟脾淋毒活疫苗中RHDV污染，根據(jù)兔出血癥病毒VP60基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了檢測兔出血癥病毒一步法反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈（RT-PCR）方法，并對其特異性、敏感性進(jìn)行了研究。該一步法RT-PCR對RHDV擴(kuò)增結(jié)果為陽性，對照毒株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；對兔出血癥病毒檢測的靈敏性為10皮克總RNA量，應(yīng)用該方法，檢測了20批豬瘟脾淋源活疫苗樣品，以上結(jié)果表明該一步法RT-PCR方法檢測速度快、特異性強(qiáng)、敏感性高，可用于豬瘟脾淋毒活疫苗中污染的RHDV外源病毒檢測。

豬瘟（Classical swine fever，CSF）又稱“爛腸瘟”，是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種嚴(yán)重危害全世界養(yǎng)豬業(yè)高度傳染、致死性疾病，我國1984年將豬瘟列為一類動(dòng)物疫病，兔瘟是由兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一種兔傳染病，該病于1984年在中國江蘇部分縣市首次暴發(fā)，現(xiàn)已擴(kuò)散到世界各地。疫苗成品出現(xiàn)污染外源性病毒現(xiàn)象常常是因?yàn)橐呙缟a(chǎn)原材料的污染所引起的，豬瘟脾淋毒活疫苗是以接種豬瘟兔化弱毒的家兔脾臟、淋巴結(jié)為原材料制成的，所以豬瘟脾淋毒活疫苗存在污染RHDV的可能性。RHDV發(fā)病的家兔死前一般無明顯臨床癥狀，不易被發(fā)現(xiàn)，一旦感染RHDV家兔的脾淋組織毒混入制備豬瘟脾淋毒活疫苗的抗原中，就會(huì)導(dǎo)致疫苗成品污染。筆者在進(jìn)行豬瘟脾淋毒活疫苗效力檢驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中1批次疫苗注射家兔2日后，家兔突然死亡，診斷為兔瘟病毒感染，于是對疫苗進(jìn)行各種檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗中污染了兔瘟病毒。雖然藥典中規(guī)定豬瘟脾淋毒活疫苗中RHDV污染的檢測方法為家兔注射法，但是我國目前還沒有SPF家兔，因此，檢測結(jié)果可能會(huì)受家兔的來源、品種和易感性等影響，且檢驗(yàn)成本較高、耗時(shí)長，常規(guī)的兔瘟病毒檢測方法如電鏡觀察、血凝（血凝抑制）試驗(yàn)等方法存在操作復(fù)雜、敏感性低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，不能滿足豬瘟中RHDV的檢測。

本研究根據(jù)GenBank公布RHDV基因序列（JF438967），針對具有很高保守性的VP60基因設(shè)計(jì)1對特異性引物，建立了一種特異、敏感的RHD檢測方法，以確保疫苗的安全、有效，為商品化豬瘟脾淋毒活疫苗中RHDV污染提供一種有效的分子生物學(xué)檢測方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

兔出血癥病毒（RHDV）、兔水皰性口炎病毒（RVSTV）、輪狀病毒（RRV）、豬藍(lán)耳病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）由本實(shí)驗(yàn)室保存，20批豬瘟脾淋源活疫苗樣品購買自不同廠家。

1.2 工具酶及試劑盒

AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司、DNA Marker、PCR相關(guān)試劑、限制性內(nèi)切酶、MD18-T載體、DNA凝膠回收試劑盒購自大連寶生物公司。

1.3 RT-PCR引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank中登錄的RHDV基因序列（JF438967），采用Primer Premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)1對引物，上游引物：5′-GGAACTTGAATGGCAGCAC-3′，下游引物：5′-TAAAGGGCACGAACGACA-3′，擴(kuò)增RHDV VP60基因部分片段201堿基對，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 病毒基因組RNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取RHDV的RNA，并提取其他幾種病毒的RNA。

1.5 RHD VP60基因的一步法RT-PCR擴(kuò)增及條件優(yōu)化

以RNA為模板進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20微毫升。各參數(shù)為50℃逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，95℃預(yù)變性2分鐘，然后進(jìn)入95℃20秒、55℃20秒、72℃20秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8分鐘。取4微毫升產(chǎn)物，1.5％瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。同時(shí)對各擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，包括退火溫度（49℃～59℃梯度溫度，每2℃為1個(gè)梯度）、引物濃度（0.1～1.1微摩爾/升，每0.2微摩爾/升為1個(gè)梯度）等，反應(yīng)體系均為20微毫升。

1.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定

首先取擴(kuò)增產(chǎn)物5微毫升在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體在16℃恒溫金屬浴中過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株DH5α。挑取單個(gè)的轉(zhuǎn)化菌落，加LB溶液培養(yǎng)18小時(shí)后用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，用PCR方法進(jìn)行鑒定，將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序鑒定，將測序結(jié)果與參照的RHDV序列同源性比較。

1.7 特異性試驗(yàn)

分別提取RHDV、RVSTV、RRV、PRRSV、CSFV、PEDV、BVDV的RNA，用已建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.8 敏感性試驗(yàn)

RHDV病毒提取RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當(dāng)于含有100納克RNA、10納克RNA、1納克RNA、100皮克RNA、10皮克RNA、1皮克RNA的含量，分別進(jìn)行一步法RT-PCR檢測，確定其敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的一步法RT-PCR檢測方法，檢測兔出血癥、兔水皰性口炎、輪狀病毒、豬藍(lán)耳病、豬瘟、豬流行性腹瀉、牛病毒性腹瀉各3份病料和3份陰性病料，重復(fù)檢測3次，以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10 豬瘟脾淋源活疫苗中兔瘟外源病毒的檢測

將購買的20批豬瘟脾淋源活疫苗樣品稀釋為含有1頭份/200微升作為檢測樣品進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陽性對照和陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定

2.1.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.5％瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物在201堿基對處可見特異性擴(kuò)增帶，與預(yù)期大小相符。

2.1.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的測序鑒定

挑取PCR鑒定陽性的菌液送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果顯示，插入到T載體的基因片段的核苷酸序列與RHDV（登錄號：（JF438967）的序列相似性為100％。

2.2 特異性試驗(yàn)

利用設(shè)計(jì)的引物和確定的最佳擴(kuò)增條件分別對RHDV、RVSTV、RRV、PRRSV、CSFV、BVDV的RNA進(jìn)行一步法RT-PCR。結(jié)果7個(gè)毒株中只有RHDV RNA能擴(kuò)增出大小為201堿基對目的片段，而其他均未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，表明本試驗(yàn)建立的方法有很好的特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn)

取5微升PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約201堿基對附近出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符。從結(jié)果可以看出，引物的一步法RT-PCR檢測靈敏度可以達(dá)到10皮克RNA。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

經(jīng)過3次重復(fù)操作，結(jié)果一致，說明建立的方法是穩(wěn)定、可靠的。

2.5 豬瘟脾淋源活疫苗中RHDV外源病毒的檢測

用建立的RHDV一步法RT-PCR檢測方法，共檢測了20批商品化豬瘟脾淋源活疫苗樣品，其中有2批有RHDV污染。

3 討論

傳統(tǒng)RHDV檢測方法具有各種弊端，如病毒分離鑒定操作繁瑣、鑒定時(shí)間長，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性不好，血凝試驗(yàn)敏感性低，檢驗(yàn)受人為影響因素多，而且對于沒有或缺乏血凝活性的RHDV毒株，在生產(chǎn)應(yīng)用中受到限制。而新發(fā)展的熒光定量PCR檢測方法雖然有很多優(yōu)勢，但所需儀器比較昂貴，且對操作人員要求較高，不適合大規(guī)模推廣應(yīng)用，傳統(tǒng)的兩部法RT-PCR檢測方法時(shí)間長，操作繁瑣，需要先反轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，本試驗(yàn)建立的RHDV一步法RT-PCR檢測方法操作簡單，不需要單獨(dú)做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增一步完成，能在3小時(shí)內(nèi)檢出RHDV，本試驗(yàn)對擴(kuò)增的退火溫度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)退火溫度值為56℃時(shí)，才能獲得較為理想的產(chǎn)物，在引物濃度為0.1～1.1微摩爾/升對PCR擴(kuò)增效率的影響不大，在0.7微摩爾/升時(shí)擴(kuò)增效率相對較高，而在1.1微摩爾/升時(shí)擴(kuò)增效率低。特異性好，而對常見的兔、豬病毒如RHDV、RVSTV、RRV、PRRSV、JEV、PEDV、BVDV擴(kuò)增結(jié)果為陰性，檢測的靈敏度可以達(dá)到10皮克RHDV RNA。用建立的RHDV一步法RT-PCR檢測方法，共檢測了20批商品化豬瘟脾淋源活疫苗樣品，其中有2批有RHDV污染。因此，商品化豬瘟脾淋源活兔瘟外源病毒還是很有必要檢測的，本試驗(yàn)所建立的方法為豬場基層獸醫(yī)工作者開展豬瘟活疫苗樣品RHDV污染的檢測提供了一種簡單、有效的分子生物學(xué)檢測方法。