肖 婷， 羅 健， 吳志雄， 李 芳， 張晶晶， 楊 軍

(南華大學附屬第一醫(yī)院心血管內科，湖南 衡陽 421001)

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硫化氫對糖尿病大鼠心肌纖維化及PPARγ、NF-κB表達的影響*

肖 婷， 羅 健， 吳志雄， 李 芳， 張晶晶， 楊 軍△

(南華大學附屬第一醫(yī)院心血管內科，湖南 衡陽 421001)

目的： 初步探討硫化氫(H2S)對糖尿病心肌纖維化的影響及其作用機制。方法: 采用鏈脲佐菌素(STZ)單次腹腔注射的方法制作大鼠糖尿病模型，以硫氫化鈉作為外源性H2S供體。將 40只雄性SD大鼠隨機分為對照組、STZ組、STZ+H2S組及H2S組，每組各10只。8周后處死大鼠，HE染色及VG染色觀察心肌膠原分布情況，并用圖像分析系統(tǒng)測量心肌間質膠原容積分數。Western blotting 觀察大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、PPARγ和NF-κB的表達水平。結果: 與對照組相比，STZ組大鼠心肌組織膠原纖維明顯增多，Ⅰ型膠原表達水平明顯升高(P<0.05)，PPARγ表達明顯減少(P<0.05)，NF-κB蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。與STZ組相比，STZ+H2S組心肌膠原纖維較少，Ⅰ型膠原表達明顯降低(P<0.05)，PPARγ表達顯著上調(P<0.05)，NF-κB蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而H2S組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原、PPARγ以及和NF-κB蛋白表達水平較對照組均無顯著差異。結論: 硫化氫可改善糖尿病心肌纖維化，其內在機制可能與PPARγ-NF-κB途徑有關。

硫化氫； 糖尿病心肌纖維化； Ⅰ型膠原； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ； 核因子κB

心肌纖維化是糖尿病所致心臟損害的重要特征，大量的膠原沉積于心肌間質，從而影響心肌收縮及舒張功能，導致心功能不全，也與心律失常，甚至心源性猝死的發(fā)生密切相關。心肌纖維化是一個復雜的病理過程，其中炎癥反應常與心肌纖維化并存，炎癥反應在糖尿病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中具有十分重要的作用。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是一類由配體激活的核轉錄因子，屬于核受體超家族成員，PPARγ已被證實在調節(jié)糖代謝、脂代謝和炎癥反應等過程中發(fā)揮著重要的作用。細胞核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)也是調控機體免疫和炎癥反應的重要轉錄因子。進一步的研究表明，PPARγ對炎癥反應的抑制作用主要是通過抑制NF-κB的活化來完成的，PPARγ通過與其配體結合而被激活，可使NF-κB活性下降或抑制其活化，從而減少細胞因子的表達，最終緩解炎癥反應[1]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是作為一種新型的氣體信號分子，參與心血管系統(tǒng)生理及病理過程的調節(jié)。它可通過擴血管、抗氧化、抗凋亡等機制，在高血壓和心肌缺血再灌注等心血管疾病中發(fā)揮一定的心肌保護作用[2]。近來徐文明等[3]發(fā)現(xiàn)H2S 可通過抑制 NF-κB 通路保護心肌細胞對抗阿奇霉素引起的炎癥反應與細胞毒性。然而，硫化氫對糖尿病心肌纖維化的影響及其內在調控機制，目前尚不清楚。

本研究通過觀察糖尿病大鼠心肌組織I型膠原、PPARγ及NF-κB表達情況，及硫化氫對其表達影響，初步探討硫化氫對糖尿病心肌纖維化的影響及其作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、藥品與試劑

40只雄性SD大鼠，體重250～300 g，由長沙SJA實驗室動物中心提供。動物飼養(yǎng)于(23±1) ℃的環(huán)境中，白天黑夜各12 h；實驗動物均可自由獲得水和食物。

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自MP Biomedicals；硫氫化鈉(H2S供體)購自Sigma；兔源Ⅰ型膠原、PPARγ及NF-κB I抗購自武漢博士德公司；鼠源GAPDH I抗購自廣州晶欣生物科技有限公司；抗兔II抗和抗鼠II抗購于武漢博士德公司；BCA蛋白定量試劑盒、細胞裂解液購于碧云天公司。

2 方法

2.1 模型建立及處理方案 將實驗大鼠適應性飼養(yǎng)1周，期間自由進食、飲水。隨后，將大鼠隨機分4組：對照組(control組)、糖尿病組(STZ組)、糖尿病硫化氫干預組(STZ+H2S組)及硫化氫對照組(H2S組)，每組各10只。大鼠禁食12 h 后，糖尿病大鼠模型通過單次腹腔注射STZ(40 mg/kg，溶解于檸檬酸鈉緩沖液中，pH 4.4)構建，非糖尿病大鼠單次腹腔注射相同劑量的檸檬酸鈉。3 d后經由尾靜脈取血，血糖高于16.7 mmol/L的大鼠視為糖尿病動物造模成功，用于后續(xù)試驗。STZ+H2S組和H2S組大鼠每日腹腔注射硫氫化鈉(100 μmol/kg)，對照組和STZ組僅注射同等劑量的生理鹽水。第8周末，采用10%水合氯醛(350 mg/kg)行腹腔注射麻醉，迅速打開胸腔，摘取心臟后用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，除去心臟周圍組織和大血管，取適量組織于甲醛中固定后用于制作石蠟切片，剩余組織保存在-80 °C冰箱，用于免疫印跡測定蛋白等。

2.2 心肌組織病理學觀察 分別取4組大鼠左心室心肌組織，用4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚4 μm, 行HE及VG染色，于光鏡下觀察攝片。采用圖像分析系統(tǒng)對VG染色圖片進行心肌組織膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)分析，CVF=膠原面積/總面積。

2.3 Western blotting檢測心肌組織中Ⅰ型膠原蛋白、PPARγ和NF-κB蛋白含量 取大鼠新鮮左心室組織，提取蛋白后進行蛋白定量；以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉法將蛋白質轉移至PVDF膜。5% BSA封閉2 h后，以Ⅰ型膠原、PPARγ、NF-κB和GAPDH I抗(稀釋度均為1∶400)37 ℃孵育1 h后4 ℃過夜，TBST洗膜3 次，洗膜后用HRP標記的II抗(稀釋度為1∶4 000)37 ℃孵育1 h，同樣用TBST洗膜3 次，ECL發(fā)光，曝光后掃描，以目的條帶和內參照條帶GAPDH的灰度比值分別表示Ⅰ型膠原蛋白、PPARγ及NF-κB的表達水平。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 大鼠心肌組織的HE染色結果

4組大鼠左心室心肌組織HE染色結果顯示STZ組大鼠心肌膠原纖維分布顯著增多，存在明顯心肌纖維化，而STZ+H2S組大鼠心肌纖維化較STZ組明顯改善，見圖1。

Figure 1.HE staining of myocardial tissues from the rats with different treatment (×200).

圖1 大鼠心肌組織HE染色結果

2 大鼠心肌組織VG染色結果

4組大鼠左心室心肌組織VG染色結果顯示STZ組大鼠心肌組織存在大量被染成紅色的膠原纖維，而STZ+H2S組大鼠心肌膠原纖維較STZ組明顯減少。膠原半定量分析結果顯示，STZ組 CVF 明顯高于對照組(P<0.05)，而STZ+H2S組CVF明顯低于STZ組(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.VG staining of myocardial tissues from the rats with different treatment (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSTZ group.

圖2 大鼠心肌組織VG 染色結果

3 4組大鼠心?、裥湍z原表達的比較

如圖3所示，與正常對照組比較，STZ組大鼠心肌組織中的Ⅰ型膠原表達水平明顯升高，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，STZ+H2S組大鼠心?、裥湍z原表達與STZ組大鼠組相比明顯下調(P<0.05)。與正常對照組相比，H2S組心?、裥湍z原表達無明顯差異。

Figure 3.The effect of hydrogen sulfide on collagen Ⅰ expression in the myocardial tissues of diabetic rats. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSTZ group.

圖3 硫化氫對糖尿病大鼠心肌組織Ⅰ型膠原表達的影響

4 4組大鼠心肌組織中PPARγ和NF-κB蛋白的表達

如圖4所示，與正常對照組相比，STZ組大鼠組心肌組織PPARγ表達水平顯著減少(P<0.05)，STZ+H2S組PPARγ較STZ組明顯上調(P<0.05)。與正常對照組相比，STZ大鼠組心肌組織NF-κB表達水平顯著升高(P<0.05)，STZ+H2S組NF-κB較STZ組明顯下調(P<0.05)。H2S組大鼠心肌PPARγ和NF-κB蛋白表達與正常對照組無明顯差異。

討 論

糖尿病心肌病是糖尿病嚴重的心血管并發(fā)癥。心肌纖維化是糖尿病心肌病主要病理特征。有研究用鏈脲佐菌素誘導糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠血清和心臟中多種炎癥細胞因子表達升高[4]。依貝沙坦可通過下調促炎因子IL-1β表達，減輕心肌纖維化程度，從而緩解糖尿病導致的左心室功能障礙，進一步提示炎癥與糖尿病心肌纖維化密切相關[5]。并且還有研究表明，通過減輕炎癥反應可緩解高血壓心肌纖維化[6]。硫化氫是一種重要的細胞信號分子，被證實在高壓力負荷和心肌缺血再灌注等病理狀態(tài)下發(fā)揮一定的心肌保護作用。與此同時，有研究發(fā)現(xiàn)氣體分子硫化氫在抑制炎癥方面具有重要的作用，并可能與其心肌保護作用有關。還有學者發(fā)現(xiàn)硫化氫可通過下調血管緊張素Ⅱ 1型受體表達抑制高血壓大鼠心肌重構[7]，但關于此氣體信號分子對糖尿病大鼠心肌病變的影響及機制的報道目前尚為少見。本實驗發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，腹腔注射鏈脲佐菌素后大鼠體重明顯下降，血糖顯著升高，說明糖尿病大鼠模型建立成功。HE染色、VG染色及Ⅰ型膠原Western blotting實驗結果顯示，與對照組相比，糖尿病大鼠心肌組織膠原纖維明顯增多，而硫化氫干預后可使糖尿病大鼠心肌中膠原的表達降低，結果提示硫化氫可在一定程度上改善糖尿病導致的心肌纖維化。

Figure 4.The effects of hydrogen sulfide on PPARγ and NF-κB expression in the myocardial tissue of diabetic rats. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsSTZ group.

圖4 硫化氫對糖尿病大鼠心肌組織PPARγ和NF-κB蛋白表達的影響

NF-κB存在于多種組織細胞中，多種參與炎癥反應的細胞因子、黏附分子和蛋白酶類的基因轉錄過程均受其調控， 因此NF-κB與炎癥的發(fā)生密切相關。NF-κB被抑制后，轉錄過程受其調節(jié)的促炎因子、黏附分子等也會受到抑制。本實驗檢測了糖尿病大鼠心肌組織中NF-κB的表達，結果顯示，糖尿病大鼠心肌組織中NF-κB表達較正常大鼠明顯升高，而糖尿病硫化氫干預組NF-κB表達較糖尿病組下降，說明糖尿病心臟組織表達升高的NF-κB可能與糖尿病心肌纖維化發(fā)生發(fā)展有關，而硫化氫在一定程度上可抑制NF-κB蛋白表達的上調，這也可能是硫化氫改善糖尿病導致的心肌纖維化的機制之一。

有學者認為PPARγ-NF-κB途徑是調控炎癥反應的一個重要的靶點。PPARγ屬于核受體超家族成員,在組織中分布廣泛，PPARs有α、β/δ 和 γ 3 種亞型。而PPARγ與其配體結合而被激活后, 不僅能直接與靶基因啟動子區(qū)域的PPAR反應元件結合發(fā)揮作用，還可通過抑制轉錄因子(包括NF-κB)活性來發(fā)揮負向的間接轉錄調控。研究發(fā)現(xiàn)PPARγ和NF-κB在組織中經常呈負相關表達，PPARγ具有明顯的免疫抑制和抗炎效應。更值得關注的是，近年發(fā)現(xiàn)PPARγ參與多種器官纖維化的發(fā)生路徑,影響纖維化的進程。如有研究發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑羅格列酮治療非酒精性脂肪性肝炎大鼠，使大鼠肝纖維化顯著改善[8]。本實驗中，糖尿病組大鼠心肌組織PPARγ表達下降，我們可推測，PPARγ蛋白表達下調可能參與了糖尿病大鼠心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。而糖尿病硫化氫干預組大鼠心肌組織的PPARγ表達較糖尿病組大鼠明顯升高，因此，硫化氫可能通過上調PPARγ表達，通過PPARγ-NF-κB途徑減輕糖尿病心肌纖維化。

本研究提示硫化氫可能通過PPARγ-NF-κB途徑改善糖尿病心肌纖維化，結果可為糖尿病心肌纖維化的發(fā)病機制研究，以及糖尿病心肌纖維化臨床治療提供了新的思路。

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Effect of hydrogen sulfide on myocardial fibrosis and PPARγ and NF-κB expression in rat model of diabetes

XIAO Ting, LUO Jian, WU Zhi-xiong, LI Fang, ZHANG Jing-jing, YANG Jun

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China.E-mail:yangjunincn@163.com)

AIM: To explore the effects of hydrogen sulfide (H2S) on the myocardial fibrosis in a rat model of diabetes and its mechanism. METHODS: Single intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) was utilized to establish a rat model of diabetes. Sodium hydrosulfide was used as an exogenous donor of hydrogen sulfide. Male SD rats were randomly divided into control group, STZ group, STZ+H2S group and H2S group. Eight weeks later, HE and VG staining methods were used to observe the collagen distribution and collagen volume fraction was measured by image analysis. The expression levels of type I collagen, PPARγ and NF-κB in the cardiac tissues were determined by Western blotting. RESULTS: Compared with control group, collagen distribution and the expression levels of type I collagen and NF-κB in the cardiac tissues were markedly increased (P<0.05), while PPARγ was significantly decreased in STZ group (P<0.05), but these indexes were reversed significantly in STZ+H2S group (P<0.05). The expression levels of type I collagen, PPARγ and NF-κB had no significant difference between H2S group and control group. CONCLUSION: Hydrogen sulfide attenuates cardiac fibrosis in diabetic rats, and its mechanism may be related to PPARγ-NF-κB signaling pathway.

Hydrogen sulfide; Diabetic myocardial fibrosis; Type I collagen; Peroxisome proliferator-activated receptor γ; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2015)04- 0635- 05

2014- 11- 07

2014- 12- 08

國家自然科學基金資助項目(No. 81202830)；湖南省自然科學基金資助項目(No. 11JJ2046)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.011

△通訊作者 Tel: 0734-8578767; E-mail： yangjunincn@163.com