呂心瑞， 徐 曉， 陳明亮， 賈建新， 王保芳， 劉建林

(河南大學 1醫(yī)學院生理教研室， 3第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475004； 2內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院基礎學院解剖學教研室，內蒙古 包頭 014060)

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Am80通過促進KLF4與維甲酸受體α相互作用抑制血管內膜增生*

呂心瑞1， 徐 曉1， 陳明亮1， 賈建新2， 王保芳1， 劉建林3△

(河南大學1醫(yī)學院生理教研室，3第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475004；2內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院基礎學院解剖學教研室，內蒙古 包頭 014060)

目的： 通過大鼠頸總動脈球囊損傷手術，探討維甲酸受體α(RARα)激動劑Am80是否通過上調Krüppel樣因子4(KLF4)與RARα相互作用而抑制血管新生內膜增生。方法: 用球囊損傷大鼠頸總動脈，腹腔注射Am80 14 d后，HE染色觀察血管新生內膜增生的情況；通過免疫組化方法檢測KLF4和血管壁中cyclin D1的表達；用Western blotting方法檢測血管壁中KLF4和RARα的表達，用免疫共沉淀法檢測KLF4和RARα的相互作用。結果: 與球囊損傷模型組比較，Am80腹腔注射組中，內膜與中膜厚度比率明顯降低，KLF4和RARα表達水平升高；而且Am80可以促進損傷血管中KLF4和RARα的相互作用。結論: Am80促進KLF4與RARα的相互作用，從而抑制血管新生內膜的增生。

Am80； Krüppel樣因子4； 維甲酸受體α; 內膜增生

在血管損傷等刺激因素下，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)可由分化表型向去分化表型(即增殖表型)轉化，使其增殖、遷移能力得以增強[1]。VSMC的異常增殖是動脈粥樣硬化、高血壓和冠狀動脈血管成形術后再狹窄等增殖性心血管疾病重要的病理學基礎，所以抑制VSMC異常增殖是逆轉血管病變和防治心血管疾病的根本措施之一。 Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是一種含有鋅指結構的轉錄因子，可直接或間接與靶基因啟動子區(qū)DNA相結合，來調控相關靶基因的表達。KLF4是與細胞分化、胚胎發(fā)育和細胞重編程等過程密切相關的轉錄因子，對多種細胞的研究表明其具有抑制細胞增殖的作用。在VSMC中，KLF4通過調節(jié)VSMC標志基因和細胞周期調節(jié)基因的表達，對VSMC表型轉化發(fā)揮重要的調節(jié)作用[2]。維甲酸受體α(retinoic acid receptor α，RARα)是一類重要的核受體，與其特異性配體結合后，通過激活或抑制一系列基因的表達而誘導細胞分化。研究表明，VSMC中存在與維甲酸結合的RARα，通過該受體，維甲酸及其衍生物能促進VSMC分化，抑制其過度增殖[3]。Am80是一種人工合成的維甲酸衍生物，是RARα的激動劑，已經在臨床上用于治療急性早幼粒細胞性白血病。在心血管組織中，Am80能誘導VSMC分化并抑制其增殖和遷移，有效抑制大鼠動脈粥樣硬化模型中血管內膜的增生[4]。但是，Am80如何通過RARα抑制血管內膜增生的分子機制仍知之甚少。本研究主要通過球囊損傷大鼠頸總動脈模型，探索Am80抑制內膜增生的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

兔抗KLF4和RARα多克隆抗體購自Abcam；IRDye? 800CW 標記的羊抗兔熒光II抗購自Rocklan；Am80和Tween-80購自Sigma。

2 方法

2.1 血管內皮剝脫動物模型的復制及分組 參照文獻[5]報道的方法，選用體重為220～280 g雄性SD大鼠，用25 %烏拉坦(3 mL /kg)腹腔麻醉。大鼠被分為假手術組(sham組)、球囊損傷組(injured組)和球囊損傷+Am80灌胃組(Am80組)。首先，各組大鼠常規(guī)消毒后，從頸外動脈遠心端結扎，頸內動脈及頸總動脈近心端用血管夾關閉血流，于頸外動脈遠心端結扎線內側剪一楔形切口，將球囊導管自切口處向近心端插入，經頸總動脈到達胸主動脈。注入約0.1 mL生理鹽水充盈球囊，然后將球囊拉回到胸主動脈起始部，其間以導絲為軸旋轉球囊，如此反復3次。Am80 組大鼠于術前1 d至術后14 d 灌胃Am80，劑量為 1 mg·kg-1·d-1，給藥期間給予普通飼料飲食；模型組大鼠，以同樣方式給予相同劑量的Tween-80。分別于術后14 d從股動脈放血處死動物，取損傷及對側血管用于實驗。

2.2 形態(tài)學分析和免疫組化染色 取頸總動脈血管按常規(guī)方法進行固定、石蠟包埋切片、HE染色。并于光鏡下觀察、照相，進行圖像學分析，計算內膜/中膜厚度比(I /M)。免疫組化染色采用SP法，滴加適當稀釋的I抗(KLF4和RARα均為1∶100稀釋)，陰性對照用PBS替代I抗。以細胞中出現棕褐色濃染顆粒作為判定陽性細胞標準，在顯微鏡下隨機選取5個視野，應用Image-Pro Plus軟件定量分析KLF4和cyclin D1陽性染色細胞數。

2.3 血管組織總蛋白的提取 分離大鼠頸總動脈，于冷PBS中洗凈血液，去除血管外結締組織，將血管剪碎后置勻漿套管中，100 mg組織加入1 mL RIPA 裂解液，冰浴勻漿。勻漿后靜置 30 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清(即蛋白提取液)，分裝儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。以牛血清白蛋白為標準品，用改良的Lowry法進行蛋白定量。

2.4 Western blotting分析 灌制8 %分離膠和5 %濃縮膠。將凍存的血管組織總蛋白，用改良的 Lowry 法進行蛋白定量。用微量加樣器將樣品加入到凝膠加樣孔內。90 V穩(wěn)壓電泳約30 min，待溴酚藍進入分離膠后，換用120 V 穩(wěn)壓電泳，至溴酚藍前緣移動到距凝膠底部0.5 mm，停止電泳，取出凝膠，進行半干轉膜，然后取出PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉2 h。將封閉后的PVDF膜置入用TTBS以適當比例稀釋的I抗溶液中，4 ℃緩慢搖動過夜。室溫洗膜，然后將PVDF膜置入用TBST 1∶20 000稀釋的IRDye? 800CW熒光標記II抗溶液中，于室溫反應1 h。室溫洗膜后用Odyssey發(fā)光儀檢測抗體結合條帶。

2.5 免疫共沉淀分析 將凍存的血管組織總蛋白，用改良的Lowry法進行蛋白定量。取上清(約80 μg蛋白)分別與2 μg的RARα抗體或KLF4抗體混合，4 ℃搖動2 h后加入 20 μL蛋白A-Sepharose，4 ℃搖動過夜，12 000 r/min 4 ℃離心，收集蛋白A-抗原-抗體復合物，依次用IPH washing buffer洗滌，洗滌后用2×SDS上樣緩沖液懸浮沉淀，100 ℃加熱5 min，室溫12 000 r/min離心，取上清進行SDS-PAGE、轉膜、5% 脫脂奶粉于室溫封閉2 h后，依次加入兔抗KLF4多克隆抗體或兔抗RARα多克隆抗體，4 ℃緩慢搖動過夜，取出PVDF膜用TBST室溫洗膜，然后將PVDF膜置入用TBST 1∶20 000稀釋的IRDye? 800CW熒光標記Ⅱ抗溶液中，室溫反應1 h，室溫洗膜后用 Odyssey發(fā)光儀檢測抗體結合條帶。

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗數據均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理，以均數±標準差(mean±SD)來表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Am80明顯抑制球囊損傷誘導的血管新生內膜的增生

HE染色結果顯示，與假手術組相比，球囊損傷頸總動脈模型組內膜明顯增厚，管腔變小，血管內膜與中膜比值明顯高于假手術組；而Am80處理組新生內膜與中膜比值明顯小于模型組(P<0.05)，見圖1。以上結果表明，Am80可以抑制血管新生內膜的增生。

Figure 1.Inhibition of Am80 on intimal hyperplasia of carotid arteries after balloon injury. Mean±SD.n=6.#P<0.05vssham group;*P<0.05vsinjured group.

圖1 Am80抑制球囊損傷誘導的血管新生內膜的增生

2 免疫組化實驗顯示KLF4及分化標志蛋白的含量

免疫組化實驗顯示，在Am80處理組的新生內膜和中膜中，KLF4的表達水平明顯增多，與模型組比較，棕黃色顆粒染色光密度也明顯增強，說明Am80可以顯著誘導KLF4表達。此外，Am80組中cyclin D1的表達與模型組比較明顯減少，提示Am80可以抑制VSMCs的細胞周期，但是KLF4是否參與抑制cyclin D1的表達有待我們進一步證實，見圖2。

3 Am80明顯升高損傷血管中KLF4與RARα表達水平

通過Western blotting方法，我們檢測模型組和Am80組中KLF4與RARα蛋白表達水平。Am80處理組可明顯提高損傷血管中KLF4與RARα的蛋白表達水平，見圖3。

4 Am80可以提高KLF4與RARα的相互作用

KLF4與RARα都是細胞表型分化中重要的核轉錄因子，而且Am80可以增加其二者表達水平。因此我們提取受損血管組織總蛋白，通過免疫共沉淀實驗檢測Am80對球囊損傷血管中二者相互作用的影響。KLF4與RARα在模型組中即存在相互作用，而給予Am80處理后，二者相互作用得到明顯增強,見圖4。

Figure 2.Immunostaining of KLF4 and cyclin D1 in the carotid arteries on day 14 after balloon injury (×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsinjured group.

圖2 免疫組化實驗顯示在球囊損傷誘導的增生血管內膜中KLF4 和cyclin D1的表達

Figure 3.Am80 up-regulated KLF4 and RARα protein levels in the carotid arteries on days 14 after balloon injury. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsinjured group.

圖3 Am80上調球囊損傷血管中KLF4和RARα的蛋白水平

Figure 4.Am80 increased the interaction between KLF4 and RARα in the vascular tissues.

圖4 Am80促進球囊損傷血管中KLF4和RARα的相互作用

討 論

雖然現有的一些研究已經表明Am80可以抑制血管內膜的增生，然而對其分子機制研究甚少。本研究證實，Am80不僅可提高KLF4的表達水平，并且通過KLF4和RARα的相互作用抑制血管內膜的增生。VSMC的異常增殖是許多血管增殖性疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、血管移植術后新生內膜形成等發(fā)生發(fā)展重要的細胞病理學基礎。Am80是一種人工合成的維甲酸類似物，是RARα的激動劑，可促進VSMC分化和抑制VSMC增殖。有研究報道[4, 6]，Am80及全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)都可以抑制大鼠血管新生內膜的增生，但是其分子機制知之甚少。KLF4是具有鋅指結構的DNA結合轉錄因子家族中的一員，參與早期胚胎發(fā)育、癌癥發(fā)生和血管形成等生理病理過程。KLF4是一個重要的促分化、抑增殖的調節(jié)因子，在心血管重塑過程中發(fā)揮著重要的調控作用。RARα 是一類重要的核受體，在體外實驗中，Am80及ATRA可通過RARα的活化而發(fā)揮誘導細胞分化、抑制細胞增殖和遷移的作用[7-8]。

動脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展都和動脈管腔狹窄有密切關系。研究發(fā)現，大部分血管管腔狹窄都伴有新生內膜的增厚和血管壁的重塑[9]。球囊損傷大鼠頸總動脈14 d后，模型組大鼠I/M比率明顯增加。在血管損傷、藥物刺激等因素作用下，VSMC可從分化表型轉化為增殖表型，并重新獲得增殖和遷移能力。VSMC在受到PDGF-BB、TGF-β1、ATRA和Am80等誘導刺激下，可以發(fā)生不同的表型轉化[10-11]。VSMC發(fā)生表型轉化是其獲得增殖、遷移和收縮能力的先決條件。在細胞實驗中，增殖型VSMC能在ATRA誘導下再分化，抑制遷移。在本研究中，Am80可以顯著減少受損血管內膜增生，并且減少cyclin D1的表達，從而通過減少細胞周期蛋白的表達，減少VSMC的增殖和遷移。另外，有研究證實，在體外實驗中，用腺病毒過表達KLF4可促進p27啟動子的轉錄活性，從而減少了細胞周期蛋白的表達，進而減少了細胞的增殖[12-13]。而且有研究也證實，通過腺病毒載體介導外源性KLF4可以抑制大鼠血管內膜的增生[14]。在本實驗中，VSMC增殖并向內膜下遷移，我們檢測到Am80不僅促進受損血管中內源性KLF4的表達水平明顯上調，而且cyclin D1的表達水平降低。所以說KLF4在VSMC表型轉化過程中起著極其重要的作用。

有研究已經證實，Am80可以通過抑制KLF5的去磷酸化，減少與RARα的相互作用，從而減少血管內膜的增生[4]。KLF5也屬于KLF家族，在許多種細胞中其角色是一個重要的促增殖、抑分化調節(jié)因子，在心血管系統(tǒng)中，其作用可與KLF4作用相互拮抗。Shi等[7]研究證實，在體外實驗中，KLF4 還可以與Sp1和RARα等轉錄因子或輔助因子相互作用，調節(jié)KLF4基因自身的轉錄，并參與促分化因子ATRA誘導的VSMC再分化過程。由此可見，KLF4是調控細胞增殖或分化的“中心因子”。而且在過表達PE-GFP-KLF4表達質粒的VSMC中，細胞增殖活力下降，細胞核內可見凋亡小體，caspase-3表達及活化水平顯著增加[15]。而本研究中，首次也證實了在體內實驗中Am80可以促進KLF4與RARα的相互作用。因此我們認為，正是由于Am80可以促進KLF4與RARα兩種核轉錄因子的相互作用，進而減少了損傷血管中內膜的增生。

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Am80 inhibits neointima hyperplasia by promoting interaction of KLF4 with RARα

Lü Xin-rui1, XU Xiao1, CHEN Ming-liang1, JIA Jian-xin2, WANG Bao-fang1, LIU Jian-lin3

(1DepartmentofPhysiology,MedicalCollege,3TheFirstAffiliatedHospital,HenanUniversity,Kaifeng475004,China;2DepartmentofAnatomy,BaotouMedicalCollege,InnerMongoliaUniverstityofScience&Technology,Baotou014060,China.E-mail:liujianlin28@126.com)

AIM: To investigate the inhibitory effect of Am80 on neointima hyperplasia in carotid arteries after balloon injury and to observe the interaction between Krüppel-like factor 4 (KLF4) and retinoic acid receptor α (RARα). METHODS: Neointima hyperplasia in carotid arteries was observed by hemotoxylin and eosin staining. The expression of KLF4 and cyclin D1 was examined by immunostaining and Western blotting analysis. To detect the interaction between KLF4 and RARα in the vascular tissue, the injured arteries were harvested, and the protein extracts were prepared and subjected to co-immunoprecipitation assay. RESULTS: Compared with injured group, Am80 significantly reduced neointimal hyperplasia and the thickness ratio of intima to media. Am80 not only up-regulated KLF4 or RARα expression in caro-tid arteries, but also increased the interaction between KLF4 and RARα at tissue levels. CONCLUSION: Am80 inhibits neointima hyperplasia in carotid arteries after balloon injury by promoting the interaction between KLF4 and RARα.

Am80; Krüppel-like factor 4; Retinoic acid receptor α; Neointima hyperplasia

1000- 4718(2015)04- 0630- 05

2014- 12- 02

2014- 12- 24

國家自然科學基金資助項目(No. U1404310)；河南大學博士啟動基金(No. B2013043)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.010

△通訊作者 Tel: 0378-23880585; E-mail: liujianlin28@126.com