王曄愷， 于 倩， 林奇龍， 姚燕珍， 梅佩玉， 李翊衛(wèi)

(舟山醫(yī)院檢驗(yàn)中心， 浙江 舟山 316004)

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miR-21反義寡核苷酸增強(qiáng)地西他濱體外抗白血病效應(yīng)*

王曄愷， 于 倩， 林奇龍， 姚燕珍， 梅佩玉， 李翊衛(wèi)△

(舟山醫(yī)院檢驗(yàn)中心， 浙江 舟山 316004)

目的： 研究miR-21反義寡核苷酸(anti-miR-21 oligonucleotide， AMO)對(duì)地西他濱(decitabine,DCA)抗白血病效應(yīng)的影響及可能機(jī)制。方法: 將AMO和無義寡核苷酸(scramble oligonucleotide, SCR)通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入HL-60細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，再分別與DCA 0.5、2.0和4.0 μmol/L作用48 h。Real-time PCR分別檢測(cè)人周期節(jié)律蛋白3(hPer3) mRNA表達(dá)，Annexin V/PI法檢測(cè)凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD117和CD11b 平均熒光強(qiáng)度(MFI)。結(jié)果: AMO轉(zhuǎn)染組miR-21表達(dá)(0.35±0.07)低于空白組(0.71±0.07)和SCR轉(zhuǎn)染組(0.66±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AMO轉(zhuǎn)染組的HL-60細(xì)胞DCA的IC50低于空白組和SCR轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。同一濃度下，AMO組的早期凋亡率、CD11b的MFI和hPer3 mRNA均高于同一濃度藥物作用的空白組和SCR組，CD117 MFI均低于同一濃度藥物作用的空白組和SCR組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論: AMO能顯著促進(jìn)DCA體外抗白血病效應(yīng)，其機(jī)制可能與其協(xié)助激活hPer3的表達(dá)有關(guān)。

人周期節(jié)律蛋白3； HL-60細(xì)胞； 微小RNA-21； 地西他濱

地西他濱(decitabine,DCA)的主要成分5-氮雜-2’-脫氧胞苷酸，為目前已知最強(qiáng)的DNA甲基化特異性抑制劑，主要用于治療中高危骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)，效果較佳，已超越傳統(tǒng)藥物。MDS是髓系中一組獲得性的、造血功能嚴(yán)重紊亂的造血干細(xì)胞的克隆性疾病，其特點(diǎn)為髓系中一系或多系血細(xì)胞發(fā)育異常和無效造血，常在數(shù)年后轉(zhuǎn)化為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)。然而DCA用于治療AML遠(yuǎn)不如MDS。微小RNA-21(microRNA-21，miR-21)在多種實(shí)體腫瘤[1-2]和部分系列的白血病[3]中呈高表達(dá)，應(yīng)用miR-21反義寡核苷酸(anti-miR-21 oligonucleotide，AMO)在體外對(duì)肺癌等實(shí)體腫瘤細(xì)胞均存在抗腫瘤效益[4]。因此，本研究將AMO轉(zhuǎn)染進(jìn)入AML HL-60細(xì)胞，觀察其對(duì)DCA的抗AML效益的影響。

材 料 和 方 法

1 反義寡核苷酸鏈設(shè)計(jì)

根據(jù)miRNA數(shù)據(jù)庫及參考其它文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)AMO 5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’(22 bp)及隨機(jī)寡核苷酸(scrambled oligonucleotide,SCR)5’-CAGGAATCGGAACATCAAAGGT-3’(22 bp)，由上海朝瑞生物科技有限公司合成。

2 藥品、試劑和儀器

地西他濱粉劑購自Sigma；CD11b-PE、CD117-PE和FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白-碘化丙啶(Annexin V/PI)凋亡試劑盒購自BD；RNA提取純化試劑盒購自Promega；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol購自Invitrogen；miR-21擴(kuò)增試劑盒購自ABI；One Step SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；小牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液購自Gibco。熒光PCR儀為ABI 7500;CO2培養(yǎng)箱為Jouan IG150;流式細(xì)胞儀為BD FACS Calibur，其中獲取軟件為CellQuest，分析軟件為FlowJo;冰凍離心機(jī)為Eppendorf 5714R。熒光定量PCR引物:hPer3上游引物為5’-ACAAACAGAACCACAAGGCA-3’,下游引物為5’-CGTCCATTTGTTGGCATTT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物94 bp；GAPDH上游引物為5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’，下游引物為5’-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物148 bp；均由上海生工生物工程公司合成。PCR儀購自Roche。

3 方法

3. 1 細(xì)胞培養(yǎng) AML細(xì)胞株HL-60購自中科院上海細(xì)胞庫。用含10%小牛血清、100 U·L-1青霉素和100 U·L-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞備用。配制密度為1×108/L的細(xì)胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，置37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

3.2 AMO轉(zhuǎn)染及效率驗(yàn)證、藥物處理 AMO和SCR均參照試劑盒說明書經(jīng)Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染到HL-60，并設(shè)立空白對(duì)照組，AMO和SCR濃度為2 μmol/L，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h，細(xì)胞培養(yǎng)液為無血清RPMI 1640。

Trizol抽提轉(zhuǎn)染前后的HL-60細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，確定其純度。Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后的miR-21表達(dá)，取3 μg總RNA和3 μL逆轉(zhuǎn)錄酶混合，在10 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中的反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行150倍稀釋。反應(yīng)體系20 μL，包括2 μL稀釋的cDNA和10 μL預(yù)混液，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。以U6 snRNA作為對(duì)照，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-21相對(duì)表達(dá)量。HL-60細(xì)胞經(jīng)上述步驟轉(zhuǎn)染后，分別與終濃度0.5、2.0和4.0 μmol/L的DCA作用48 h，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)水平。

3.3 Annexin V/PI標(biāo)記法觀察細(xì)胞凋亡 3.2步驟中細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌棄上清，殘?jiān)?xì)胞收集至流式管。每管加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，避光靜置15 min，加300 μL預(yù)冷的PBS，振蕩混勻上機(jī)檢測(cè)其早/中晚期凋亡率。

3.4 分化抗原CD117和CD11b檢測(cè) 3.2步驟中細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌棄上清，殘?jiān)?xì)胞收集至流式管。每管依次加CD117-PE和CD11b-PE各5 μL，加300 μL預(yù)冷的PBS，振蕩混勻上機(jī)檢測(cè)，用FlowJo軟件分析平均熒光強(qiáng)度。

3.5 人周期節(jié)律蛋白3(human period circadian protein 3，hPer3) mRNA檢測(cè) hPer3和GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建：用Trizol提取細(xì)胞總RNA，鑒定完整性和純度，取5 μg總RNA冰上逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，反應(yīng)體系25 μL：其中DNA模板2 μL，10 μmol/L hPer3或GAPDH熒光定量PCR引物各1 μL，5×PCR緩沖液5 μL, 加去RNA酶水補(bǔ)至25 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后，加入連接緩沖液5 μL、純化的目的片斷4.5 μL和pMD18-T載體0.5 μL，低速離心后于16 ℃連接過夜，將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后涂氨芐青霉素平板，挑取單菌落培養(yǎng)過夜，抽提其質(zhì)粒通過PCR鑒定陽性重組子，送上海生工公司測(cè)序確證。將重組質(zhì)粒倍比梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，用cDNA進(jìn)行SYBR Green I熒光染料嵌合法檢測(cè)，反應(yīng)體系參照試劑說明書，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。利用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)樣品中的目的基因和內(nèi)參照基因分別進(jìn)行定量，白血病細(xì)胞株中hPer3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為hPer3與GAPDH比值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件，對(duì)各組中的抑制率、早期凋亡率及分化抗原平均熒光強(qiáng)度采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染效率

空白組(blank組)、SCR轉(zhuǎn)染組(SCR組)和AMO轉(zhuǎn)染組(AMO組)的miR-21相對(duì)表達(dá)量(U6 snRNA為內(nèi)參照)分別為0.71±0.07、0.66±0.05和0.35±0.07，AMO-21轉(zhuǎn)染組miR-21表達(dá)低于空白組和SCR轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。

2 細(xì)胞藥敏

空白組、SCR組和AMO組DCA的IC50分別為(3.05±0.46) μmol/L、(2.96±0.34) μmol/L和(1.48±0.13) μmol/L，AMO組低于空白組和SCR組(P<0.01)。

3 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)凋亡

各DCA濃度中，AMO組的早期凋亡率均高于同一藥物濃度組的空白組和SCR組(P<0.01)，見圖1、2。

Figure 1.Early apoptotic rates of HL-60 cells treated with diffe-rent concentrations of DCA. Mean±SD. n=6 **P<0.01 vs blank and SCR at the same DCA concentration.

Figure 2.Representative flow cytometry images of early apoptosis of HL-60 cells treated with DCA at concentrations of 0 and 4.0 μmol/L.

4 分化抗原CD117和CD11b檢測(cè)

除未加藥組(DCA 0 μmol/L)外，各藥物濃度組中AMO組的細(xì)胞CD117平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)均低于同一濃度組中的blank組和SCR組(P<0.01)。除未加藥組(DCA 0 μmol/L)外，各藥物濃度組中AMO組的細(xì)胞CD11b MFI均高于同一濃度組中的blank組和SCR組(P<0.01)，見圖3。

5 hPer3 mRNA檢測(cè)

各藥物濃度組中，AMO組的hPer3 mRNA表達(dá)均高于同一藥物濃度組的blank組和SCR組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

Figure 3.Mean fluorescence intensities of CD117 (A) and CD11b (B) in HL-60 cells treated with different concentrations of DCA. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs blank and SCR at the same DCA concentration.

Figure 4.hPer3 mRNA relative expression in HL-60 cells treated with different concentrations of DCA. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs blank and SCR at the same concentration.

討 論

DCA是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)MDS效果最佳的化療藥物，雖然在臨床上MDS和AML能相互轉(zhuǎn)歸，但從國外治療現(xiàn)狀來看，對(duì)AML單一使用DCA并未取得良好的效果，目前這種機(jī)制尚不清楚。目前的研究熱點(diǎn)在于如何使用其它藥物或手段增強(qiáng)DCA對(duì)AML的療效，使其達(dá)到或接近MDS的治療水平。在此方面近期的研究也取得一些進(jìn)展，比如作為一種表觀遺傳學(xué)藥物，組蛋白去乙酰酶抑制劑丙戊酸鈉(VPA)聯(lián)用在體外[5]和體內(nèi)[6]均能增強(qiáng)DCA的藥效。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類具有高度保守性的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小分子單鏈RNA，其中miR-21在幾乎所有實(shí)體腫瘤包括胰腺癌中存在高表達(dá)，而且高表達(dá)的miR-21可能發(fā)揮類似原癌基因的作用。在腫瘤細(xì)胞中針對(duì)性抑制miR-21表達(dá)不僅能直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖的生物學(xué)特性，例如敲除或抑制miR-21能有效地抑制一些白血病細(xì)胞的生物學(xué)特性[7-8]，還能間接地增強(qiáng)一些化療藥物如阿糖胞苷[9]的抗腫瘤細(xì)胞的效果。本研究顯示，2 μmol/L AMO轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h后，HL-60細(xì)胞對(duì)DCA的IC50降至普通的一半左右，極大提升DCA抑制細(xì)胞的效果。同時(shí)，AMO和DCA還能共同作用于細(xì)胞早期凋亡和分化，CD117作為c-Kit受體膜外區(qū)分子表面抗原標(biāo)志，多數(shù)AML的原始細(xì)胞中均有CD117的表達(dá)，并且CD117的高M(jìn)FI和細(xì)胞的惡性程度相關(guān)，往往預(yù)示著預(yù)后不良[10]。AMO協(xié)同DCA降低CD117的MFI從分化抗原角度說明它們能共同作用于降低腫瘤細(xì)胞的惡性程度。CD11b是泛髓系標(biāo)記，主要表達(dá)于粒系、單核等髓系細(xì)胞，其表達(dá)量和細(xì)胞成熟度呈正相關(guān)，AMO和DCA能共用提升HL-60細(xì)胞的CD11b MFI，并且從流式直方圖上顯示，4.0 μmol/L濃度DCA和AMO共同作用后，腫瘤細(xì)胞已經(jīng)分化為一個(gè)幼稚群(低MFI峰)和一個(gè)成熟群(高M(jìn)FI峰)，這意味著AMO和DCA能共同促進(jìn)幼稚髓系腫瘤細(xì)胞向成熟髓系細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

已有的研究顯示：miR-21常見的直接作用靶標(biāo)有PTEN[11]、PDCD4、TIMP3、bcl-2等基因, 通過與靶基因mRNA 3’-UTR 完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。hPer3基因不僅作用于其它時(shí)鐘基因相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，還直接作用于細(xì)胞周期調(diào)控，在體內(nèi)表達(dá)降低易引起腫瘤細(xì)胞增殖，體外過表達(dá)也能引起腫瘤細(xì)胞的凋亡[12]。本研究顯示，單獨(dú)的AMO能提升hPer3 mRNA的表達(dá)，卻幅度不高。將與DCA作用的HL-60細(xì)胞經(jīng)過AMO轉(zhuǎn)染預(yù)處理后，卻能較大幅度加強(qiáng)DCA促hPer3的表達(dá)能力。其原因可能如下：AMO對(duì)hPer3的表達(dá)影響可能有兩方面：正面作用：hPer3可能是miR-21的作用靶標(biāo)(經(jīng)TargetScan驗(yàn)證其Pct值為0.69),AMO直接抑制miR-21從而提升了hPer3的表達(dá)；反面作用：由于miR-21還能通過直接抑制DNMT1基因上游信號(hào)分子RASGRP1而間接抑制DNMT1酶的表達(dá)[13]，而AMO的轉(zhuǎn)染恰恰提升了DNMT1酶的作用，抑制了hPer3的表達(dá)。未與DCA作用前，兩方面的作用相互制衡，以正面作用略占優(yōu)勢(shì)。DCA作為一種DNMT酶抑制劑，AMO轉(zhuǎn)染后與大劑量的DCA作用，其反面作用被抑制，從而在大劑量DCA組中觀察到hPer3表達(dá)的大幅提升。總之，AMO加強(qiáng)DCA的抗白血病效應(yīng)中有hPer3的激活參與，然而， miR-21對(duì)hPer3的靶標(biāo)作用過程目前尚未完全清楚，還需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Enhanced anti-leukemic activity of decitabine to leukemia HL-60 cells by anti-miR-21 oligonucleotide

WANG Ye-kai, YU Qian, LIN Qi-long, YAO Yan-zhen, MEI Pei-yu, LI Yi-wei

(ClinicalLaboratory,ZhoushanHospital,Zhoushan316004,China.E-mail:wangyekai@163.com)

AIM: To investigate the role of anti-miR-21 oligonucleotide (AMO) in the anti-leukemic activity of decitabine (DCA)invitro. METHODS: AMO and scramble oligonucleotide (SCR) were constructed and transfected into HL-60 cells. The miR-21 expression was analyzed by real-time PCR to identify the transfection efficiency. The cells were treated with DCA at gradient concentrations (0.5, 2.0 and 4.0 μmol/L) for 48 h. The mRNA expression of human period circadian protein 3 (hPer3) was detected by real-time PCR. The early apoptotic rates were determined by flow cytometry with Annexin V/PI staining. Mean fluorescence intensities (MFI) of CD117 and CD11b were also measured by flow cytometry. RESULTS: The miR-21 relative expression level in AMO group was significantly lower than that in blank group and SCR group (P<0.01). IC50of DCA in AMO group was significantly lower than that in blank group and SCR group (P<0.01).With the same concentration of DCA, the early apoptotic rate, the mRNA expression of hPer3 and the MFI of CD11b in AMO group were significantly higher than those in blank group and SCR group (P<0.01). The MFI of CD117 in AMO group were significantly lower than those in blank group and SCR group (P<0.01). CONCLUSION: Activation of hPer3 expression plays an important role in enhanced anti-leukemic activity of decitabine by AMOinvitro.

Human period circadian protein 3; HL-60 cells; MicroRNA-21; Decitabine

1000- 4718(2015)01- 0109- 05

2014- 06- 06

2014- 10- 10

舟山市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011C12044)

△通訊作者 Tel: 0580-2292892; E-mail: wangyekai@163.com

R733.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.021