王沛堅， 王秋林， 楊 震， 王 芳， 蒲春華， 李文章， 梁登攀， 周 鵬

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,四川 成都 610500)

?

PPARγ激動劑通過上調(diào)解偶聯(lián)蛋白2抑制高糖介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成*

王沛堅， 王秋林， 楊 震， 王 芳， 蒲春華， 李文章， 梁登攀， 周 鵬△

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,四川 成都 610500)

目的： 探討過氧化物酶體增殖物受體γ(PPARγ)對高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧(ROS)生成的影響及機制。方法: 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)以高糖(33 mmol/L D-葡萄糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)，并以低糖培養(yǎng)基(5.5 mmol/L D-葡萄糖)作為對照。分別利用超氧陰離子和一氧化氮(NO)的熒光探針觀察PPARγ激動劑比格列酮對高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞超氧陰離子和NO水平的影響，以Western blotting法觀察解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)的表達(dá)。結(jié)果: PPARγ激動劑比格列酮可顯著抑制高糖介導(dǎo)的ROS生成，并可防止高糖介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NO水平的下降，而上述作用可被PPARγ的阻斷劑GW9662所阻斷。PPARγ激動劑可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞UCP2的表達(dá)，而通過genipin抑制UCP2可顯著減弱PPARγ激動劑的作用。結(jié)論: 激活PPARγ可顯著抑制高糖介導(dǎo)的ROS的生成，而該作用可能與其上調(diào)UCP2的表達(dá)有關(guān)。

過氧化物酶增殖物受體γ； 解偶聯(lián)蛋白2； 氧化應(yīng)激； 內(nèi)皮細(xì)胞

糖尿病是心血管疾病的重要危險因素，相關(guān)的心腦血管并發(fā)癥如腦卒中、冠心病、慢性心力衰竭等是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病[1]。最新的調(diào)查研究表明，我國目前已有1.14億的糖尿病患者，而成人中更有50%的糖尿病前期患者[2]。因此，對于糖尿病及其相關(guān)心血管并發(fā)癥的防治是我國面臨的一個重大公共衛(wèi)生問題。內(nèi)皮損傷是眾多心血管疾病的起始環(huán)節(jié)。高糖環(huán)境下通過多種途徑如糖基化終末產(chǎn)物、多元醇代謝途徑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、線粒體功能障礙等導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害[3-4]。目前的共識認(rèn)為，氧化應(yīng)激是上述的途徑造成血管內(nèi)皮損害的共同環(huán)節(jié)[5-6]。但外源性補充抗氧化劑如維生素C和維生素E等對心血管疾病的遠(yuǎn)期療效研究結(jié)果仍存在一定的爭議[7-8]。研究表明，過氧化物酶體增殖物受體(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)不但具有顯著的代謝保護(hù)作用，還由于其特有的抗氧化應(yīng)激作用對衰老相關(guān)的心腦血管功能障礙具有良好的改善作用[9]。但PPARγ對高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激的影響及其相關(guān)的機制尚無相關(guān)的報道。在本研究中，我們擬利用高糖復(fù)制內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，觀察PPARγ對高糖介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響及對其機制進(jìn)行初步的探索。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和實驗材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (human umbilical vein endothelial cells， HUVECs) 購于江蘇省齊氏生物科技有限公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱(SHELDON)；去離子水過濾器(Millipore)； pH 計和核酸蛋白分析儀(Beckman)；勻漿機(IKA)；電泳儀(Bio-Rad)；凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad)； TE2000-U倒置熒光顯微鏡(Nikon)。

二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)、4,5-二氨基乙酰乙酸熒光素(4,5-diaminofluorescein diacetate，DAF-2DA; Sigma)；抗GAPDH抗體和抗UCP2抗體(Santa Cruz)；胎牛血清(Hyclone)，抗生素和DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)。

2 方法

2.1 細(xì)胞的分組及培養(yǎng) HUVECs用低糖DMEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清和1%抗生素)于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。分組處理如下：(1)對照(control)組 (干預(yù)時給予同體積的DMSO)；(2) 高糖(high glucose, HG)組(含33 mmol/L的D-葡萄糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng))； (3)HG+比格列酮(pioglitazone, PIO)組(高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞中加入比格列酮，10 μmol/L)；(4)HG+PIO+GW9662組(高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞中加入比格列酮10 μmol/L，GW9662 5 μmol/L)；(5)HG+PIO+京尼平(genipin，10 μmol/L)組干預(yù)時間為24 h。細(xì)胞種于6孔板中，每組至少重復(fù)3次。

2.2 DHE染色[10]取適量DHE染料溶于DMSO中配制成0.01 mol/L的儲備液，4 ℃避光儲存。在干預(yù)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中加入終濃度為40 mmol/L的染色液，37 ℃避光孵育30 min。用新鮮Krebs溶液洗滌3次后熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。Krebs 溶液(mmol/L)：NaCl 119,NaHCO325,glucose 11.1,KCl 4.7,KH2PO41.2,MgSO41.2,CaCl22.5,pH 7.4。

2.3 內(nèi)皮細(xì)胞NO水平的測定[10]在干預(yù)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中加入終濃度為5 mmol/L的DAF-2DA，37 ℃避光孵育45 min。用Krebs溶液洗滌3次后置于熒光顯微鏡下，用FITC濾光片進(jìn)行照相。

2.4 Western blotting[10]取100 mg 細(xì)胞加入裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度。蛋白上樣量50 μg，經(jīng)SDS-PAGE 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，封閉后加入 I抗和Ⅱ 抗，化學(xué)發(fā)光試劑增強反應(yīng)，X 線片壓片曝光，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS 13.0 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD) 表示，采用非配對t檢驗進(jìn)行組間比較分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Prism 3.0 軟件制圖。

結(jié) 果

1 PPARγ激動劑抑制高糖介導(dǎo)的HUVECs活性氧生成

與低糖對照組比較，高糖環(huán)境可顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成 (P<0.01)；PPARγ激動劑比格列酮(10 μmol/L)可顯著抑制高糖環(huán)境下活性氧的生成 (P<0.01)；而該作用可顯著被PPARγ阻斷劑GW9662(5 μmol/L)或genipin(10 μmol/L)所阻斷，(P<0.01)，見圖1。

2 PPARγ激動劑顯著防止高糖環(huán)境介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NO水平的下降

與低糖對照組比較，高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞的NO水平顯著下降(P<0.01)；PPARγ激動劑比格列酮可顯著防止高糖環(huán)境下NO水平的下降(P<0.01)；但該作用同樣可被PPARγ阻斷劑GW9662(5 μmol/L)或genipin(10 μmol/L)所阻斷，見圖2。

3 PPAR γ激動劑可顯著上調(diào)UCP2的表達(dá)

近年研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ可調(diào)控線粒體蛋白UCP2，而UCP2是近年被發(fā)現(xiàn)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的線粒體膜蛋白[11-12]。因此，我們利用Western blotting法分析了PPARγ的激動劑對UCP2的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPARγ可顯著上調(diào)高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞UCP2的蛋白表達(dá) (P<0.01)；而該作用同樣可被PPARγ的阻斷劑所阻斷(P<0.01)，見圖3。

Figure 1.The effect of PPARγ agonist on high glucose-induced ROS level elevation in HUVECs.Mean±SD. n=6. ## P<0.01 vs control group; **P<0.01 vs HG group; △△ P<0.01 vs HG+PIO group.

討 論

高糖環(huán)境導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平的升高是糖尿病致血管損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。內(nèi)皮作為血管組織的第一屏障最先遭受ROS的攻擊。近年發(fā)現(xiàn)，PPARs(包括PPAR、PPARβ/δ和PPARγ)不但具有顯著的代謝改善作用，還具有良好的血管保護(hù)作用[13]。已知臨床常用的PPARγ激動劑吡格列酮具有顯著的降糖效應(yīng)，但其是否有獨立于降糖以外的保護(hù)糖尿病狀態(tài)下血管內(nèi)皮的效應(yīng)，目前并無相關(guān)的研究報道。在本研究中我們首先觀察了吡格列酮對高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑吡格列酮可顯著抑制高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的升高并可被PPARγ的拮抗劑阻斷。氧化應(yīng)激水平的升高可導(dǎo)致具有內(nèi)皮保護(hù)作用的NO水平下降，從而進(jìn)一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的損害[14]。我們利用NO的熒光探針進(jìn)一步分析了吡格列酮對高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞NO水平的影響。與既往的研究一致，高糖環(huán)境可顯著減少內(nèi)皮細(xì)胞NO的水平，而吡格列酮可顯著防止高糖介導(dǎo)的NO水平的下降。上述結(jié)果提示吡格列酮具有顯著的保護(hù)高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮損害的作用，而該作用是通過激活PPARγ實現(xiàn)的。

但PPARγ對高糖環(huán)境介導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用機制是什么？既往研究證實，PPARγ可顯著上調(diào)線粒體蛋白UCP2mRNA轉(zhuǎn)錄水平，而該作用可能依賴于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的磷酸化[11, 15]。UCP2作為線粒體內(nèi)膜上的蛋白，其介導(dǎo)的質(zhì)子漏可降低線粒體膜電位從而防止線粒體活性氧的生成[16]。近年研究發(fā)現(xiàn)，UCP2是機體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的一個重要分子，機體氧化應(yīng)激水平的升高可致其激活，從而使轉(zhuǎn)錄水平升高，表達(dá)增加，是機體應(yīng)對氧化應(yīng)激的一種反饋性調(diào)節(jié)機制。UCP2不但具有對抗衰老介導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生的增加，延長壽命的作用，還具有防止高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能損害，通過過表達(dá)UCP2可顯著防止高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙[17-18]。為此，我們利用Western blotting的方法觀察了PPARγ對UCP2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑可顯著上調(diào)高糖環(huán)境下UCP2的表達(dá)水平。為進(jìn)一步明確UCP2對PPARγ介導(dǎo)的血管內(nèi)皮保護(hù)作用的影響，我們進(jìn)一步利用UCP2抑制劑genipin觀察其對PPARγ激動劑吡格列酮效應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，genipin可顯著抑制吡格列酮的作用，提示PPARγ拮抗高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷的作用依賴于UCP2。

綜上所述，我們的研究結(jié)果證實了PPARγ激動劑吡格列酮可顯著防止高糖介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平的升高，而該作用可能是通過上調(diào)UCP2而實現(xiàn)的。雖然已知氧化應(yīng)激是高糖介導(dǎo)的血管損害的關(guān)鍵機制，但維生素C和維生素E等外源性的抗氧化劑防治心血管疾病仍存在一定的爭議。因此，PPARγ調(diào)控的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激靶點UCP2可為相關(guān)心血管疾病的防治提供新的干預(yù)思路。

[1] Raja L, Palanivelu S, Panchanatham S. Anti-inflammatory property of Kalpaamruthaa on myocardium in type 2 diabetes mellitus induced cardiovascular complication[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2012, 35(1):119-125.

[2] Xu Y, Wang L, He J, et al. Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J]. JAMA, 2013, 310(9):948-959.

[3] Boudina S, Abel ED. Diabetic cardiomyopathy, causes and effects[J]. Rev Endocr Metab Disord, 2010, 11(1):31-39.

[4] 吳健美，陳曉娜，郭正祥，等. Rho激酶在糖尿病血管內(nèi)皮功能改變中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(6):1103-1108.

[5] Sasaki S, Inoguchi T. The role of oxidative stress in the pathogenesis of diabetic vascular complications[J]. Diabetes Metab J, 2012, 36(4):255-261.

[6] 劉江月.梓醇對糖尿病大鼠主動脈的保護(hù)作用與抗氧化機制研究[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(6):1023-1028.

[7] Lonn E, Bosch J, Yusuf S, et al. Effects of long-term vitamin E supplementation on cardiovascular events and cancer: a randomized controlled trial[J]. JAMA, 2005, 293(11):1338-1347.

[8] Sesso HD, Buring JE, Christen WG, et al. Vitamins E and C in the prevention of cardiovascular disease in men: the Physicians’ Health Study II randomized controlled trial[J]. JAMA, 2008, 300(18):2123-2133.

[9] Erol A. The functions of PPARs in aging and longevity[J]. PPAR Res， 2007, 2007:39654.

[10]Pu Y, Zhang H, Wang P, et al. Dietary curcumin ameliorates aging-related cerebrovascular dysfunction through the AMPK/uncoupling protein 2 pathway[J]. Cell Physiol Biochem, 2013, 32(5):1167-1177.

[11]Bugge A, Siersbaek M, Madsen MS, et al. A novel intronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma enhancer in the uncoupling protein (UCP) 3 gene as a regulator of both UCP2 and -3 expression in adipocytes[J]. J Biol Chem, 2010, 285(23):17310-17317.

[12]Ma S, Ma L, Yang D, et al. Uncoupling protein 2 ablation exacerbates high-salt intake-induced vascular dysfunction[J]. Am J Hypertens, 2010, 23(8):822-828.

[13]Duan SZ, Usher MG, Mortensen RM. PPARs: the vasculature, inflammation and hypertension[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2009, 18(2):128-133.

[14]Sun J, Pu Y, Wang P, et al. TRPV1-mediated UCP2 upregulation ameliorates hyperglycemia-induced endothelial dysfunction[J]. Cardiovasc Diabetol, 2013, 12:69.

[15]Lopez-Solache I, Marie V, Vignault E, et al. Regulation of uncoupling protein-2 mRNA in L6 myotubules: I: Thiazolidinediones stimulate uncoupling protein-2 gene expression by a mechanism requiring ongoing protein synthesis and an active mitogen-activated protein kinase[J]. Endocrine, 2002, 19(2):197-208.

[16]Cabrera JA, Ziemba EA, Colbert R, et al. Uncoupling protein-2 expression and effects on mitochondrial membrane potential and oxidant stress in heart tissue[J]. Transl Res, 2012, 159(5):383-390.

[17]Tian XY, Wong WT, Xu A, et al. Uncoupling protein-2 protects endothelial function in diet-induced obese mice[J]. Circ Res, 2012, 110(9):1211-1216.

[18]Andrews ZB, Horvath TL. Uncoupling protein-2 regulates lifespan in mice[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2009, 296(4):E621-E627.

PPARγ agonist inhibits high glucose-induced production of reactive oxygen species by UCP2 up-regulation

WANG Pei-jian, WANG Qiu-lin, YANG Zhen, WANG Fang, PU Chun-hua, LI Wen-zhang, LIANG Deng-pan, ZHOU Peng

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China.E-mail:ap216g@163.com)

AIM: To explore the effects of PPARγ on the elevated level of reactive oxygen species (ROS) induced by high glucose and its mechanism. METHODS: Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured with DMEM containing high glucose (33 mmol/L D-glucose), and DMEM containing lower glucose (5.5 mmol/L D-glucose) was used as control. Superoxide anion and nitric oxide fluorescence probes were used to observe the effects of PPARγ agonist on ROS and NO productions in the HUVECs. The uncoupling protein 2 (UCP2) protein level in the HUVECs was detected by Western blotting. RESULTS: PPARγ agonist pioglitazone inhibited the ROS generation and prevented the decrease in NO level under high glucose condition, and these effects were reversed by pretreatment with PPARγ antagonist GW9662. The results of Western blotting indicated that PPARγ agonist pioglitazone up-regulated the UCP2 expression under high glucose condition, and this effect was also blocked by GW9662. Inhibition of UCP2 by genipin attenuated the effect of pioglotazone on the ROS production. CONCLUSION: Activation of PPARγ inhibits ROS generation under high glucose condition, and this effect may mediate by up-regulation of UCP2.

Peroxisome proliferator-activated receptor γ; Uncoupling protein 2; Oxidative stress; Endothelial cells

1000- 4718(2015)01- 0049- 05

2014- 05- 22

2014- 11- 11

四川省教育廳科研項目(No. 14ZB0234)；成都醫(yī)學(xué)院科研項目(No. CYZ13-001)

△通訊作者 Tel: 028-83016644； E-mail: ap216g@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.010