鄧海靜， 李世峰， 張麗娟， 薛新新， 杜世璞， 孫 月， 徐 洪， 楊 方

(河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心, 老年醫(yī)學(xué)國(guó)際科技合作基地， 河北 唐山 063000)

?

·論 著·

Ac-SDKP經(jīng)HSP27調(diào)節(jié)鋅指蛋白而抑制肺上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化*

鄧海靜， 李世峰， 張麗娟， 薛新新， 杜世璞， 孫 月， 徐 洪， 楊 方△

(河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心, 老年醫(yī)學(xué)國(guó)際科技合作基地， 河北 唐山 063000)

目的： 探討N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)是否通過抑制熱休克蛋白27(heat-shock protein 27，HSP 27)的表達(dá)，進(jìn)而抑制鋅指蛋白SNAI1、SNAI2的表達(dá)，而發(fā)揮阻抑轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1誘導(dǎo)的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞(肌成纖維細(xì)胞)的轉(zhuǎn)化以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)。方法: 激光共聚焦檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化中HSP27及SNAI1、SNAI2蛋白的共定位表達(dá)；real-time PCR法檢測(cè)HSP27、SNAI1和SNAI2 mRNA的表達(dá)；Western blotting法檢測(cè)HSP27、SNAI1、SNAI2和Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，以及轉(zhuǎn)染HSP27干擾質(zhì)粒后SNAI1、SNAI2蛋白及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，TGF-β1刺激組HSP27、SNAI1、SNAI2及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增強(qiáng)；給予Ac-SDKP干預(yù)后，HSP27、SNAI1、SNAI2及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用HSP27的干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)擾細(xì)胞后，SNAI1、SNAI2及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)降低，其中SNAI1和Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)與TGF-β1刺激組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Ac-SDKP干預(yù)的結(jié)果相似。結(jié)論: Ac-SDKP能夠通過對(duì)HSP27表達(dá)的調(diào)節(jié)，降低鋅指蛋白SNAI1和SNAI2的表達(dá)，進(jìn)而抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及膠原蛋白的合成。

N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸； 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞； 肌成纖維細(xì)胞； 熱休克蛋白27； 鋅指蛋白SNAI1； 鋅指蛋白SNAI2

在矽肺纖維化時(shí)，肌成纖維細(xì)胞可由肺間質(zhì)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來[1]。肌成纖維細(xì)胞的另一個(gè)重要來源是支氣管和肺泡上皮細(xì)胞[2]。因此上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitiont, EMT)，包括向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，與(矽)肺纖維化的形成密切相關(guān)[3]。最近我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法在大鼠矽肺模型中篩選出了33個(gè)與矽肺發(fā)生密切相關(guān)的差異蛋白，其中熱休克蛋白27(heat shock protine 27，HSP27)是比較典型的差異蛋白之一。HSP27蛋白是分子量為27 kD的小分子量熱休克蛋白，隸屬于小分子量的熱休克蛋白家族，它們都含有1個(gè)保守的C末端結(jié)構(gòu)域，即α-晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域，通過與核轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白SNAI1的相互調(diào)節(jié)參與了器官纖維化的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[4]。鋅指蛋白家族的另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白SNAI2參與了腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，使腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[5]。

N-乙?；?絲氨酰-天門冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartly-lysyl-proline, Ac-SDKP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種抗器官纖維化的短肽，在心、肝、腎和肺纖維化中均能夠抑制致病因素引起的器官纖維化[6]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP具有拮抗大鼠矽肺纖維化的作用，能夠通過抑制肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和膠原合成，從而發(fā)揮抗矽肺纖維化的作用[7]。然而，Ac-SDKP能否通過對(duì)HSP27表達(dá)的調(diào)節(jié)阻抑鋅指蛋白SNAI1和SNAI2的表達(dá)，進(jìn)而抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及膠原蛋白的合成，目前國(guó)內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用體外人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合特異性沉默HSP27基因的實(shí)驗(yàn)方法，觀察Ac-SDKP是否通過對(duì)HSP27與鋅指蛋白SNAI1、SNAI2調(diào)節(jié)途徑，阻抑了TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，以闡明Ac-SDKP抑制(矽)肺纖維化作用的可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與材料

A549人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(PAA)；TGF-β1(Peprotech)；Ac-SDKP(Bachem)；兔多克隆抗體I型、III型膠原(Gene Tex)；鼠HSP27單克隆抗體(Abcam)；兔多克隆SNAI1抗體(Anbobio)；兔多克隆SNAI2抗體(Aviva)；兔多克隆抗體GAPDH和鼠單克隆抗體β-actin(Santa Cruz)；SP免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉)；real-time PCR試劑盒及Lepo 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；羊抗鼠、兔免疫熒光Ⅱ抗(KPL)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)次融合狀態(tài)時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要接種于不同的培養(yǎng)板(皿)中。分組誘導(dǎo)前無血清同步化24 h。實(shí)驗(yàn)分組為：(1)對(duì)照組(control組)，無血清DMEM培養(yǎng)72 h；(2)TGF-β1誘導(dǎo)組(TGF-β1組)，無血清DMEM培養(yǎng)條件下，給予TGF-β1(5 μg/L)誘導(dǎo)刺激72 h；(3)Ac-SDKP藥物干預(yù)組(TGF-β1+Ac-SDKP組)，無血清DMEM培養(yǎng)條件下給予Ac-SDKP(10-8mol/L)1 h后，再給予TGF-β1(5 μg/L)共同孵育細(xì)胞72 h。

3 方法

3.1 免疫印跡檢測(cè) 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行誘導(dǎo)干預(yù)后，提取細(xì)胞蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，以每個(gè)泳道50 μg蛋白上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜。將膜放入配好的不同濃度的抗體中(E-cad、α-SMA、HSP27、SNAI1、SNAI2、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原1∶200稀釋；GAPDH和β-actin 1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜，Ⅱ抗羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(1∶5 000)37 ℃孵育2 h，BCIP/NBT顯色劑顯色1 min。用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶測(cè)量光密度值，目的蛋白條帶與相應(yīng)內(nèi)參照光密度值之比為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3.2 Real-time PCR檢測(cè) 提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定純度及濃度，對(duì)目的基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)合成。HSP27 sense：5’-GCTTCACGCGGAAATACACG-3’, antisense：5’-GTGATCTCGTTGGACTGCGT-3’；SNAI1 sense：5’-TAGCGAGTGGTTCTTCTGCG-3’，antisense：5’-GGGCTGCTGGAAGGTAAACT-3’；SNAI2 sense：5’-ACGCCTCCAAAAAGCCAAAC-3’, antisense：5’-ACAGTGATGGGGCTGTATGC-3’; β-actin sense：5’-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3’，antisense：5’-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTT-3’。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA的合成，取目的RNA樣本2～4 μL (20 mg/L)，依次加入引物、合成緩沖液等共20 μL反應(yīng)體系，37 ℃孵育50 min，70 ℃加熱15 min以終止反應(yīng)。Platinum SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒用于DNA的擴(kuò)增與檢測(cè)。將正反引物和對(duì)應(yīng)cDNA加入蒸餾水和SYBR，混勻置于SLAN熒光定量PCR儀中，按照預(yù)先設(shè)定程序進(jìn)行擴(kuò)增，共40循環(huán)。用2-ΔΔCt法分析基因表達(dá)變化，與內(nèi)參照比較后分析數(shù)據(jù)。

3.3 激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè) 以6×103每孔的密度制備細(xì)胞爬片，按照細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行誘導(dǎo)干預(yù)。取出爬片后4%多聚甲醛固定30 min，滴加0.2% Triton X-100破膜30 min，后高壓修復(fù)90 s。切片擦拭干凈，滴加HSP27、SNAI1和SNAI2抗體(1∶100比例)、濕盒內(nèi)避光4 ℃冰箱孵育過夜。次日取出PBS沖洗Ⅰ抗30 min，后加入TRITC和FITC標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠免疫熒光Ⅱ抗于37 ℃濕盒避光孵育2 h。Hoechst 33258復(fù)染胞核5 min。于激光共聚焦顯微鏡掃描(Olympus FV1000)視野下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察與拍照(×800)。

3.4HSP27 shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建與篩選 以6×103每孔的密度在6孔板里孵育細(xì)胞。待細(xì)胞長(zhǎng)滿密度達(dá)90%～100%時(shí)，開始做細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用轉(zhuǎn)染效率最高的轉(zhuǎn)染條件即Lepo 2000∶HSP27 shRNA質(zhì)粒為5 μL∶2 μg的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h。用real-time PCR 檢測(cè)，分析數(shù)據(jù)，篩選出干擾效果最好的HSP27 shRNA片段。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間均數(shù)比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

結(jié) 果

1 Ac-SDKP對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)刺激肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的HSP27、SNAI1、 SNAI2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

對(duì)照組細(xì)胞呈單個(gè)圓形，HSP27蛋白主要在胞漿內(nèi)有少量綠色微弱熒光表達(dá)，SNAI1蛋白在胞核內(nèi)有少量紅色熒光表達(dá)，SNAI2蛋白亦在胞核內(nèi)有少量紅色熒光表達(dá)；經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)刺激后，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形改變，胞漿內(nèi)HSP27蛋白綠色熒光強(qiáng)度明顯加強(qiáng)，胞核內(nèi)SNAI1蛋白表達(dá)紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而SNAI2蛋白除了在胞核內(nèi)有紅色熒光表達(dá)外，在胞漿內(nèi)也出現(xiàn)了紅色熒光表達(dá)；給予Ac-SDKP干預(yù)后，細(xì)胞長(zhǎng)梭形變化不甚明顯，胞漿內(nèi)HSP27蛋白綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，胞核內(nèi)SNAI1蛋白表達(dá)紅色熒光強(qiáng)度亦隨之減弱，SNAI2蛋白胞核和胞漿的紅色熒光表達(dá)亦減弱，見圖1、2。

Figure 1.The colocalization of HSP27 and SNAI1 on A549 alveolar epithelial cells induced by TGF-β1 observed under confocal laser scanning microscope.

Figure 2.The colocalization of HSP27 and SNAI2 on A549 alveolar epithelial cells induced by TGF-β1 observed under confocal laser scanning microscope.

Real-time PCR結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)72 h后，HSP27、SNAI1和SNAI2 的mRNA表達(dá)上調(diào)，HSP27的 mRNA表達(dá)是對(duì)照組的1.9倍，SNAI1 的mRNA表達(dá)是對(duì)照組的3.1倍，SNAI2的mRNA表達(dá)是對(duì)照組的2.3倍。給予Ac-SDKP干預(yù)后， HSP27、SNAI1和SNAI2 的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，HSP27的mRNA表達(dá)下調(diào)到TGF-β1組的64%，SNAI1的 mRNA表達(dá)下調(diào)到TGF-β1組的38%，SNAI2 的mRNA表達(dá)下調(diào)到TGF-β1組的79%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 Real-time PCR檢測(cè)Ac-SDKP 對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)HSP27、SNAI1和 SNAI2 mRNA表達(dá)的影響

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

Western blotting的結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)刺激72 h后，HSP27、SNAI1和SNAI2的蛋白表達(dá)上調(diào)，其中HSP27的表達(dá)是對(duì)照組的1.9倍。SNAI1蛋白的表達(dá)是對(duì)照組的1.3倍；SNAI2蛋白的表達(dá)是對(duì)照組的1.9倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而給予Ac-SDKP干預(yù)后，再給予TGF-β1誘導(dǎo)72 h，HSP27、SNAI1和SNAI2蛋白表達(dá)下調(diào)。其中HSP27的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)組的74%；SNAI1蛋白的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)組的75%，SNAI2蛋白表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)組的66%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2 Ac-SDKP對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)刺激肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)刺激72 h后，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)上調(diào)，其中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)是對(duì)照組的2.2倍，Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)是對(duì)照組的2.5倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而給予Ac-SDKP干預(yù)后，Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)組的66%，Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)組的44%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.The effect of Ac-SDKP on the expression of HSP27, SNAI1, SNAI2 in A549 alveolar epithelial cells induced by TGF-β1.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs TGF-β1 group

3 Ac-SDKP對(duì)體外轉(zhuǎn)染HSP27細(xì)胞上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、HSP27、SNAI1、SNAI2、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle altin，α-SMA)、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的變化

Western blotting的結(jié)果同時(shí)顯示，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組對(duì)比，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組，上皮標(biāo)志蛋白E-cad表達(dá)明顯降低，E-cad表達(dá)是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的48%，HSP27、SNAI1、SNAI2、α-SMA、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增高，HSP27的表達(dá)是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的1.5倍，SNAI1的表達(dá)是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的1.7倍，SNAI2的表達(dá)是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的1.5倍，間質(zhì)標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá)是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的1.5倍,Ⅰ型膠原的表達(dá)是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的1.7倍,Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的1.7倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染HSP27的干擾質(zhì)粒后，給予TGF-β1誘導(dǎo)，與TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組對(duì)比，E-cad表達(dá)明顯上調(diào)，是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的2.2倍，HSP27、SNAI1、α-SMA、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)降低，HSP27的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的53%，SNAI1的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的63%，α-SMA的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的51%，Ⅰ型膠原的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的50%，Ⅲ型膠原的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的60%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SNAI2蛋白表達(dá)亦降低，是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的78%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組對(duì)比，給予Ac-SDKP干預(yù)后，E-cad表達(dá)明顯增加，是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的2.1倍，HSP27、SNAI1、SNAI2、α-SMA、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)明顯降低，HSP27的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的46%，SNAI1的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的57%，SNAI2的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的51%，α-SMA的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的47%，Ⅰ型膠原的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的32%，Ⅲ型膠原的表達(dá)是TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的50%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這一結(jié)果與轉(zhuǎn)染HSP27的干擾質(zhì)粒后的干預(yù)結(jié)果相似，見圖5。

Figure 4.The effect of Ac-SDKP on the expression of collagen type Ⅰ and collagen type Ⅲ in A549 alveolar epithelial cells induced by TGF-β1.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs TGF-β1 group.

討 論

我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在TGF-β1誘導(dǎo)刺激下，肺成纖維細(xì)胞和A549肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞都能夠向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步證實(shí)了TGF-β1這個(gè)重要的細(xì)胞因子能夠促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[8-9]。

HSP27是熱休克蛋白家族成員中的一個(gè)小分量的蛋白，較多文獻(xiàn)報(bào)道了HSP27調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程依賴于HSP27與鋅指蛋白SNAI1的相互作用[10]。SNAI1蛋白為細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子，是鋅指蛋白SNAIL超家族成員，是胚胎發(fā)育中促進(jìn)中胚層和神經(jīng)嵴形成的非常重要的轉(zhuǎn)錄因子[11]。在人特發(fā)性肺纖維化疾病中，SNAI1蛋白與E-cad近端啟動(dòng)子上的E盒結(jié)合，而抑制E-cad的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞表型的變化。SNAI1可以被蛋白體酶降解而失去活性和其調(diào)節(jié)功能。而HSP27可以通過抑制蛋白體酶對(duì)SNAI1蛋白的降解，使SNAI1在細(xì)胞核內(nèi)聚集并增加了SNAI1轉(zhuǎn)錄因子的活性，誘導(dǎo)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程[4]。在單側(cè)輸尿管梗阻所致的腎小管間質(zhì)纖維化模型中，HSP27表達(dá)增高。腎小管上皮細(xì)胞過表達(dá)HSP27后，SNAI1蛋白表達(dá)反而降低，E-cad表達(dá)增高。HSP27通過對(duì)SNAI1的負(fù)向調(diào)節(jié)，阻抑了腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)的轉(zhuǎn)變[12]。將人HSP27基因片段插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞株(NRK52E)，能明顯降低由TGF-β1刺激誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中SNAI1蛋白的表達(dá)，而增加E-cad的表達(dá)。這些結(jié)果提示，HSP27通過對(duì)SNAI1的負(fù)向調(diào)節(jié)，阻抑了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，對(duì)腎臟纖維化的形成起到了保護(hù)作用，這與上述特發(fā)性肺纖維化過程中，HSP27與SNAI1作用后的調(diào)控結(jié)果正好相反[10]。SNAI1和SNAI2蛋白的N末端區(qū)有高度的同源性，在C末端區(qū)有4～5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(兩者又稱為鋅指因子)。在食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和肺癌中SNAI2蛋白的表達(dá)與E-cad的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，目前作為腫瘤預(yù)后、轉(zhuǎn)化程度的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)[13]。然而，HSP27以及SNAI1和SNAI2是否通過相互的調(diào)節(jié)，參與了在肺纖維化的形成？目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用TGF-β1誘導(dǎo)刺激A549肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞時(shí)，HSP27在蛋白水平和mRNA水平表達(dá)均增強(qiáng)，并伴有SNAI1和SNAI2蛋白和mRNA表達(dá)的上調(diào)，蛋白表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平的變化趨勢(shì)相一致。我們又應(yīng)用熒光抗體標(biāo)記法在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)HSP27和SNAI1、SNAI2蛋白在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)有共同的定位與表達(dá)。提示HSP27蛋白可能是通過與SNAI1和SNAI2蛋白的表達(dá)參與了TGF-β1誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)過程。

Figure 5.The effect of Ac-SDKP on transfected cultured A549 cells induced by TGF-β1. A: empty vector; B: empty vector+TGF-β1; C: HSP27 shRNA+TGF-β1; D: empty vector +TGF-β1+Ac-SDKP. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs empty vector; #P<0.05 vs TGF-β1+empty vector.

為進(jìn)一步探討HSP27與鋅指蛋白SNAI1、SNAI2蛋白的相互調(diào)節(jié)在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，我們應(yīng)用脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法將HSP27干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將HSP27干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞后，再給予TGF-β1誘導(dǎo)刺激，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比較，HSP27蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，并伴隨SNAI1和SNAI2蛋白表達(dá)的下調(diào)，其中SNAI1蛋白的下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而SNAI2蛋白的下調(diào)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)α-SMA蛋白的表達(dá)下調(diào)，E-cad蛋白表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步印證了HSP27蛋白能夠通過對(duì)鋅指蛋白SNAI1和SNAI2的調(diào)節(jié)，在TGF-β1誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。

Ac-SDKP是具有抗纖維化作用的四肽，在體外大鼠肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)中，Ac-SDKP能顯著抑制p38介導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的增殖以及膠原的合成；并且Ac-SDKP能通過對(duì)TGF-β1及其受體介導(dǎo)的血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)和α-SMA的調(diào)控，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制膠原蛋白的合成與表達(dá)，發(fā)揮其抗(矽)肺纖維化的作用[14]。在我們這項(xiàng)研究中，當(dāng)給予Ac-SDKP對(duì) TGF-β1誘導(dǎo)A549肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)時(shí)，能顯著下調(diào)HSP27蛋白的表達(dá)，并伴隨鋅指因子SNAI1、SNAI2表達(dá)的下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞的Ⅰ型膠原及Ⅲ膠原蛋白表達(dá)也顯著下降；在mRNA表達(dá)水平檢測(cè)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，Ac-SDKP干預(yù)后能顯著下調(diào)HSP27和SNAI1、SNAI2 mRNA的表達(dá)，這與蛋白水平的表達(dá)趨勢(shì)相一致。這一結(jié)果證實(shí)了，Ac-SDKP能夠通過對(duì)HSP27與鋅指因子SNAI1、SNAI2蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，抑制了TGF-β1誘導(dǎo)A549肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化并阻抑了細(xì)胞膠原蛋白的表達(dá)與產(chǎn)生。這一調(diào)控的過程與規(guī)律與體外應(yīng)用脂質(zhì)體將HSP27干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞后所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。提示，Ac-SDKP通過對(duì)HSP27和鋅指因子SNAI1、SNAI2蛋白表達(dá)的調(diào)控，抑制了肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制膠原蛋白的合成，而發(fā)揮其抗(矽)肺纖維化的作用。

[1] Xu H, Yang F, Sun Y, et al. A new antifibrotic target of Ac-SDKP: inhibition of myofibroblast differentiation in rat lung with silicosis[J]. PLoS One, 2012， 7(7):e40301.

[2] Liang H, Gu Y, Li T, et al. Integrated analyses identify the involvement of microRNA-26a in epithelial-mesenchymal transition during idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Cell Death Dis，2014, 2(5):e1238.

[3] Zhao H, Wu QQ, Cao LF, et al. Melatonin inhibits endoplasmic reticulum stress and epithelial-mesenchymal transition during bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice[J]. PLoS One,2014, 9(5):e97266.

[4] Wettstein G, Bellaye PS, Kolb M, et al. Inhibition of HSP27 blocks fibrosis development and EMT features by promoting Snail degradation[J]. FASEB J,2013, 27(4):1549-1560.

[5] Krohn A, Ahrens T, Yalcin A, et al. Tumor cell heterogeneity in Small Cell Lung Cancer (SCLC): phenotypical and functional differences associated with Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) and DNA methylation changes[J]. PLoS One，2014, 9(6):e100249.

[6] Danilov SM, Wade MS, Schwager SL, et al. A novel angiotensin I-converting enzyme mutation (S333W) impairs N-domain enzymatic cleavage of the anti-fibrotic peptide, AcSDKP[J]. PLoS One，2014, 9(2):e88001.

[7] 李淑鈺，徐 洪，孫 月，等. Ac-SDKP對(duì)ROCK通路介導(dǎo)矽肺大鼠成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化抑制作用[J]. 中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué), 2013, 40(2):95-99.

[8] 馬文東，袁 媛，楊 奕，等. TGF-β1介導(dǎo)的RhoA/ROCK通路在肺成肌纖維細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2013,29(10):1758-1763.

[9] 于婉瑩，徐 洪，鄧海靜，等. N-乙?；?絲氨酰-天門冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸對(duì)人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用[J]. 解剖學(xué)雜志, 2013, 36(4):711-715.

[10]Vidyasagar A, Reese S, Acun Z, et al. HSP27 is involved in the pathogenesis of kidney tubulointerstitial fibrosis[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2008, 295(3):F707-F716.

[11]Park YM,Lee YH, Kim SH, et al. Snail, a transcriptional regulator, represses adiponectin expression by directly binding to an E-box motif in the promoter[J]. Metabolism, 2012, 61(11):1622-1632.

[12]Vidyasagar A, Reese SR, Hafez O, et al. Tubular expression of heat-shock protein 27 inhibits fibrogenesis in obstructive nephropathy[J]. Kidney Int, 2013, 83(1):84-92.

[13]Phillips S,Prat A, Sedic M, et al. Cell-state transitions regulated by slug are critical for tissue regeneration and tumor initiation[J]. Stem Cell Reports，2014, 2(5):633-647.

[14]袁 媛，楊 方，徐 洪，等. Ac-SDKP對(duì)ROCK通路介導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用[J]. 中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2013, 31(9):654-660.

Inhibitory effect of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline on epithelial-mesenchymal transition by heat-shock protein 27/zinc finger proteins

DENG Hai-jing, LI Shi-feng, ZHANG Li-juan, XUE Xin-xin, DU Shi-pu, SUN Yue, XU Hong, YANG Fang

(ExperimentalandResearchCenter,HebeiUnitedUniversity,GerontologyInternationalScienceandTechnologyCooperationBase，Tangshan063000,China.E-mail:fangyang1955@163.com)

AIM: To detect whether N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (Ac-SDKP) inhibits epithelial-mesenchymal transition in A549 cells induced by TGF-β1 through suppressing the expression of heat shock protein 27 (HSP27) and zinc finger proteins Snail (including SNAI1and SNAI2) which ultimately inhibited the deposition of type I and type III collagens. METHODS: The colocalizations of HSP27 and SNAI1/SNAI2 respectively on A549 alveolar epithelial cells induced by TGF-β1 were measured by confocal microscopy. The expression of HSP27, SNAI1 and SNAI2 at mRNA level was detected by real-time PCR. Western blotting analysis was used to detect the expression of HSP27, SNAI1 and SNAI2 on epithelial-mesenchymal transition in A549 cells induced by TGF-β1 and also the deposition of type I and type III collagens in A549 cells transfected with HSP27shRNA prior to TGF-β1 stimulation.RESULTS: Compared with control group, TGF-β1 increased the expression of HSP27, SNAI1, SNAI2, type I and type III collagen, which decreased significantly followed by Ac-SDKP intervention. The expression of SNAI1, type I and type III collagen decreased significantly after transfected with HSP27shRNA in A549 cells, which had the similar effect on Ac-SDKP intervention.CONCLUSION: Ac-SDKP inhibits the transition of cultured A549 cells to myofibroblasts and attenuates collagen synthesis by suppressing the expression of HSP27 and zinc finger proteins SNAI1 and SNAI2.

N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline; TypeⅡalveolar epithelial cells; Myofibroblasts; Heat shock protein 27; Zinc finger protein SNAI1; Zinc finger protein SNAI2

1000- 4718(2015)01- 0001- 07

2014- 08- 04

2014- 09- 19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81072254； No. 81302395)； 河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No. ZD20131035)； 唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 13130299z)

△通訊作者 Tel: 0315-3725495； E-mail: fangyang1955@163.com

R329.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.001