田 飛，李翠新，何 德

（西南林業(yè)大學，云南 昆明650224）

1 引言

在構(gòu)建全長cDNA文庫時，連接和轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵步驟。在做樣品與載體連接之前，去除由PCR擴增不完全和限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的非全長cDNA片段是必不可少的工作，殘留的非全長cDNA片段會直接影響連接效果，影響建成文庫的代表性、冗余度和挑取單克隆測序的工作量[1～3]。而SMART技術(shù)中去除非全長cDNA片段的方法也由其創(chuàng)立的CLONTECH公司從2001年的膠回收法[4]，改為 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法，而在近幾年又改為CHROMA－SPIN 400柱離心法。然而多年來廣大的科研工作者大多數(shù)只是對其提供的去除方法進行延用，卻沒有見到對這3種方法進行平行比較和取舍的研究報道[5，6]。本文作者通過實驗發(fā)現(xiàn)最新的CHROMA－SPIN 400柱離心法的純化效果并不理想，所以對這3種方法做了一個綜合比較，以期得到最經(jīng)濟有效的純化方法，為后繼實驗者提供指導(dǎo)和參考。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

小桐子花采自云南省昭通市巧家縣。瓊脂糖購自BIOWEST公司，膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，CHROMA－SPIN 400柱購自CLONTECH公司，PCR儀購自 BIORAD公司，型號為 C1000TM Thermal cycler，槍頭和離心管購自美國Labnet公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2 擴增并酶切cDNA

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用PCR儀擴增后，取160μL擴增液，用SfiⅠ限制性內(nèi)切酶酶切處理，備用。具體操作參照 CLONTECH 公司的 CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit說明書。

2.3 膠回收法純化

取50μL酶切過的PCR擴增液跑瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒做膠回收，膠回收液標記為1號處理液，－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法純化

取20個滅菌處理過的2mL離心管，編號1到20。從冰箱中取出一支CHROMA－SPIN 400柱，室溫放置1h活化，顛倒數(shù)次后垂直放置于一支架上，讓管中的樹脂重新沉降成柱。30min后，待樹脂柱上表面清晰可見，掰斷舍棄尾，揭開頂蓋，排出柱中緩沖液，再往柱中添加TE緩沖液沖洗依次，待尾管處停止滴液后，給尾管套上白尾套。取50μL酶切過的PCR擴增液，小心加到樹脂上表面的中心位置。待樣品液完全被樹脂柱吸收后，打開尾管，用移液槍往柱中滴加TE緩沖液沖洗，并立刻用標記好的離心管依次放于尾管下承接洗脫液，每管接一滴，直至接滿20管。立即做瓊脂糖凝膠電泳檢測，合并最早出現(xiàn)條帶的前三管洗脫液，標記為2號處理液，－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 CHROMA－SPIN 400柱離心法純化

從冰箱中取出一支CHROMA－SPIN 400柱，室溫放置1h活化，顛倒數(shù)次后垂直放置于一支架上，讓管中的樹脂重新沉降成柱。沉降完全后，掰斷舍棄尾，并迅速套上一個配套的收集管，揭開頂蓋，700g，離心5min。將收集管連同管中的收集液一起丟掉，拿一個新的配套收集管給純化柱套上，取50μL酶切過的PCR擴增液，小心加到樹脂柱上表面的中心位置，700g室溫離心5min，純化好的cDNA樣品即在新的收集管中。取出純化柱，給收集管蓋上蓋子，標記為3號處理液體，－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 濃縮純化液體至等體積

為控制變量，將3份純化液濃縮至等體積。具體方法為往3份純化液中各添加1／10倍體積3mol／L的NaAc，1.3μL濃度為20μg／μL的糖原溶液和2.5倍體積－20℃預(yù)冷的95%乙醇，搖晃混勻后置于－20℃冰箱中冷凍1h助沉。1h后取出離心管，14000g室溫離心20min。用槍頭小心吸去上清，再添加100μL80%的乙醇震蕩洗滌一次。14000g低溫離心后，吸去乙醇層，酒精燈旁晾干沉淀，再均以7μL RNase－free水溶解沉淀。

3 結(jié)果與分析

3.1 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法電泳檢測結(jié)果

CHROMA－SPIN 400柱重力自流法的20管洗脫液，每管取3μL，用瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖1所示，含有樣品的洗脫液出現(xiàn)在15、16、17、18四管中，而且這四管洗脫液的條帶在500bp處都有一細窄的亮帶，是由急劇的cDNA含量減少造成的，說明CHROMA－SPIN 400柱重力自流法讓樣品液中小于500bp的cDNA片段的量有了明顯的減少。

圖1 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法洗脫液檢測電泳圖

3.2 三份處理液濃縮至等體積后電泳檢測結(jié)果

取1、2、3號濃縮液和未處理的酶切過的RT－PCR擴增液各3μL做瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2。

圖2 三種方法純化液濃縮至等體積后電泳圖

3種方法的處理液電泳檢測都有條帶，CHROMA－SPIN 400柱離心法的條帶與膠回收法的條帶亮度接近，說明這兩種方法回收率接近，都較低，且都顯著低于CHROMA－SPIN 400柱重力自流法的回收率。而從圖4中可以較明確的看到經(jīng)CHROMA－SPIN 400柱重力自流法和CHROMA－SPIN 400柱離心法處理過的樣品液電泳圖在低于500bp范圍內(nèi)仍然有彌散帶出現(xiàn)，而膠回收法在500bp以下處幾乎沒有暗帶了，說明膠回收法除去小分子cDNA片段較徹底，而另兩種方法雖然使500以下cDNA片段有明顯減少，但去除并不徹底。

3.3 綜合對比三種方法

結(jié)合以上檢測結(jié)果，從成本、實驗用時、去除效果、回收率和一次處理溶液量對3種方法進行綜合比較，如表1所示。

表1 三種方法綜合比較表

4 結(jié)語

從綜合對照表和電泳對比圖中我們可以看到最新的CHROMA－SPIN 400柱離心法除了操作較簡單，實驗較快捷之外，在小分子去除效果上與CHROMASPIN 400柱重力自流法相比并沒有優(yōu)勢，而且關(guān)鍵的回收率遠不及CHROMA－SPIN 400柱重力自流法。而膠回收法實驗用時最少，而且小分子片段去除較徹底，只是回收率較低。所以綜合來看，當樣品量較多時適宜采用膠回收法，不僅小分子片段去除較徹底，成本最低，而且可一次處理大量樣品，省時；當樣品量較少時，適宜采取CHROMA－SPIN 400柱重力自流法保證回收率，雖然費時一點；反倒是最新的CHROMASPIN 400柱離心法在關(guān)鍵的回收率和小分子去除效果兩方面與另兩種方法對比，都處于劣勢，所以不可取。

筆者分析認為CHROMA－SPIN 400柱離心法與CHROMA－SPIN 400柱重力自流法相比，回收率之所以低很多，是因為離心力使大孔樹脂之間聚集太緊密，阻礙了cDNA片段的通過，而重力自流法中的大孔樹脂聚集只受重力，不受離心力，所以聚集程度適中，大分子cDNA片段剛好能通過，而小分子cDNA則被大孔樹脂吸附。而膠回收法之所以回收率較低，主要是因為有大量核酸樣品殘留在瓊脂糖中，未被選擇性溶出，隨離心廢液一起丟棄了。改變點樣量，膠回收中殘留洗脫不下來的損失樣品量基本不變，所以一次點樣越多，損失量不變，回收率就相對提高，可以用這種方法來相對提高膠回收率。另外，最近報道有凍融法、透析袋電洗脫法和低溶點瓊脂糖[7]等新的膠回收方法能夠顯著提高膠回收率，相信這些方法能夠彌補膠回收法回收率低這一缺點，而且膠回收法具有要去除的片段大小可以通過肉眼直觀，選擇切出，選擇范圍自由的優(yōu)點。

所以從長遠來看，最有潛力成去除全長cDNA溶液中非全長cDNA片段的最佳方法的是膠回收法。

[1]龍松華，陳信波，鄧 欣，等.SMART技術(shù)構(gòu)建亞麻韌皮部全長cDNA文庫[J].中國麻業(yè)科學，2008，30（3）：128～130.

[2]張 震，王教瑜，杜新法，等.稻曲病菌cDNA文庫的構(gòu)建[J].植物病理學報，2008，38（5）：462～467.

[3]付 楊，高 翔，敖 曼，等.香雪蘭花瓣總RNA的提取和cDNA文庫的構(gòu)建[J].東北師大學報：自然科學版，2008，40（3）：118～121.

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[7]胡 靜，溫進坤.三種從瓊脂糖凝膠回收DNA片段方法的比較[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志，1994，11（4）：238.