孫建梅　鄭桂紅　劉纏民　等

摘要：為了評(píng)價(jià)水環(huán)境中Ni2+對(duì)魚類的影響，并為預(yù)防和治理淡水漁業(yè)水質(zhì)資源的鎳污染提供一定的理論依據(jù)，采用靜水生物測(cè)試法，研究0、10、25、50、100 mg/L NiSO4·6H2O對(duì)鯽魚肝胰臟和腸中酶活性的影響。結(jié)果表明：低濃度的NiSO4·6H2O對(duì)肝胰臟中脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶有激活作用，在高濃度時(shí)呈抑制作用；而對(duì)堿性磷酸酶一直表現(xiàn)為抑制作用。低濃度的NiSO4·6H2O對(duì)腸中胰蛋白酶、脂肪酶、ACP和AKP有激活作用，高濃度時(shí)呈現(xiàn)出抑制作用。

關(guān)鍵詞：硫酸鎳；鯽魚；肝胰臟；腸；酶活性

中圖分類號(hào)： S965.117；S917.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0239-03

收稿日期：2014-03-07

基金項(xiàng)目：江蘇省徐州市科技計(jì)劃（編號(hào)：XF11C051）；江蘇省化學(xué)生物學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科基金（編號(hào)：PAPD）。

作者簡(jiǎn)介：孫建梅（1962—），女，江蘇徐州人，副教授，從事動(dòng)物學(xué)的教學(xué)和科研工作。

通信作者：鄭桂紅，女，山東鄆城人，博士研究生，講師，從事動(dòng)物生理學(xué)的教學(xué)和科研工作。E-mail： ghzhenghf@163.com。隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，大量的鉛、鎘、鎳、汞等重金屬隨污水流入江海湖泊，嚴(yán)重破壞了水域生態(tài)環(huán)境，影響魚類的正常生長(zhǎng)繁殖[1]。目前，關(guān)于鎳和其他重金屬毒理學(xué)的研究多集中在致死濃度與水生動(dòng)物體內(nèi)鎳的積累量等方面，而重金屬離子對(duì)魚類消化酶活性影響的研究較少[2]。因此，本研究以野生鯽魚肝胰臟和腸中脂肪酶、胰蛋白酶、AKP和ACP為指標(biāo)，研究不同濃度的NiSO4對(duì)鯽魚肝胰臟和腸中酶活性的影響，旨在研究Ni2+對(duì)魚類消化酶的影響機(jī)制，為保證魚類的健康和防治環(huán)境污染提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物野生鯽魚，購(gòu)自江蘇徐州文沃市場(chǎng)，選擇健康活潑、體表完好的鯽魚100尾，體長(zhǎng)（9±2） cm、體質(zhì)量（20±2） g/尾，隨機(jī)分為5組，分別為0、10、25、50、100 mg/L NiSO4[3]。放養(yǎng)于室內(nèi)水族箱中，每箱88 L水，以充分曝氣 3 d 的自來水作為靜水水源，24 h持續(xù)充氧，溶氧量為6 mg/L，保持水溫（23±1） ℃、pH值 68。采用靜水法將鯽魚預(yù)飼養(yǎng)1周，預(yù)試驗(yàn)期間死亡率低于5%，試驗(yàn)前24 h停止飼喂，試驗(yàn)期間不換水。

1.1.2藥品和試劑蛋白定量測(cè)試盒（100T/96樣）、脂肪酶測(cè)試盒（50T/48樣）、胰蛋白酶測(cè)試盒（50T/48樣）、酸性磷酸酶（ACP）測(cè)試盒（50T/48樣），以上均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒（50T/48樣），0.9%生理鹽水，NiSO4·6H2O。

1.1.3試驗(yàn)儀器YV-7504單光束紫外-可見分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、BS 124S型電子天平[0.1 mg～120 g，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、玻璃勻漿器、微量移液槍（1、0.1 mL）等。

1.2試驗(yàn)方法

隨機(jī)抽取毒性試驗(yàn)96 h之后的鯽魚（至少3尾），解剖取樣，對(duì)肝胰臟中各指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，評(píng)價(jià)NiSO4對(duì)鯽魚的影響。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行處理。組間數(shù)據(jù)的兩兩比較采用配對(duì)樣本進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05、P<001表示差異顯著、極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1NiSO4對(duì)鯽魚肝胰臟中胰蛋白酶活性的影響

由表1可知，隨著NiSO4濃度的升高，蛋白濃度呈上升趨勢(shì)，且NiSO4濃度越高，蛋白濃度上升越明顯。在NiSO4濃度為50 mg/L時(shí)，蛋白濃度顯著上升；在NiSO4濃度為100 mg/L時(shí)，蛋白濃度極顯著上升（P<0.01）。當(dāng)NiSO4濃度≤25 mg/L 時(shí)，胰蛋白酶活性增強(qiáng)；但當(dāng)NiSO4濃度≥50 mg/L 時(shí)，胰蛋白酶活性減弱。可見，低濃度NiSO4對(duì)胰蛋白酶活性有促進(jìn)作用，高濃度NiSO4對(duì)其有抑制作用，其中10、100 mg/L NiSO4處理的胰蛋白酶活性與對(duì)照差異顯著（P<0.05），25 mg/L NiSO4處理的胰蛋白酶活性與對(duì)照差異極顯著（P<0.01）。當(dāng)NiSO4濃度≤25 mg/L時(shí)，脂肪酶活性緩慢增強(qiáng)；但當(dāng)NiSO4濃度≥50 mg/L時(shí)，脂肪酶活性急劇減弱。可見，低濃度NiSO4對(duì)脂肪酶活性有細(xì)微的促進(jìn)作用，高濃度NiSO4對(duì)其具有明顯的抑制作用，其中25 mg/L NiSO4處理的脂肪酶活性與對(duì)照差異顯著（P<0.05），100 mg/L NiSO4處理的脂肪酶活性與對(duì)照差異極顯著（P<0.01）。當(dāng)NiSO4濃度≤25 mg/L時(shí)，酸性磷酸酶活性呈增強(qiáng)趨勢(shì)，但在50 mg/L之后，酶活性減弱?？梢?，低濃度NiSO4對(duì)酸性磷酸酶活性有促進(jìn)作用，高濃度NiSO4對(duì)其有抑制作用，其中25、100 mg/L NiSO4與對(duì)照差異顯著（P<0.05）。堿性磷酸酶活性在NiSO4濃度為10 mg/L時(shí)就表現(xiàn)出減弱的趨勢(shì)，且隨著NiSO4濃度的升高而減弱得更明顯，在NiSO4濃度為10～50 mg/L 之間時(shí)，堿性磷酸酶活性減弱最明顯，其中25、50、100 mg/L NiSO4與對(duì)照差異顯著（P<0.05）。表1鎳對(duì)鯽魚肝胰臟中胰蛋

由表2可知，隨著NiSO4濃度的升高，蛋白濃度呈上升趨勢(shì)，而且濃度越高，蛋白濃度上升越明顯，其中25、50、100 mg/L NiSO4 處理的蛋白濃度與對(duì)照差異顯著（P<005）。當(dāng) NiSO4 濃度≤50 mg/L時(shí)，胰蛋白酶活性增強(qiáng)；但當(dāng)NiSO4 濃度>50 mg/L 時(shí)，胰蛋白酶活性反而會(huì)減弱，可見低濃度NiSO4 對(duì)胰蛋白酶活性有促進(jìn)作用，高濃度NiSO4 對(duì)其有抑制作用，其中25、100 mg/L NiSO4 處理與對(duì)照差異顯著（P<0.05），50 mg/L NiSO4 處理與對(duì)照差異極顯著（P<001）。當(dāng)NiSO4 濃度>50 mg/L 時(shí)，脂肪酶活性呈緩慢增強(qiáng)的趨勢(shì)，但當(dāng)NiSO4 濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，脂肪酶活性急劇減弱，可見低濃度 NiSO4 對(duì)脂肪酶活性具有細(xì)微的促進(jìn)作用，高濃度 NiSO4 對(duì)其具有明顯的抑制作用，其中10、25 mg/L NiSO4 處理與對(duì)照差異極顯著（P<0.01），50、100 mg/L NiSO4 處理與對(duì)照差異顯著（P<0.05）。當(dāng) NiSO4濃度 ≤50 mg/L 時(shí)，酸性磷酸酶活性呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，但當(dāng)其濃度達(dá)到 100 mg/L 時(shí)，酸性磷酸酶活性減弱，可見低濃度 NiSO4 對(duì)酸性磷酸酶活性有促進(jìn)作用，高濃度 NiSO4 對(duì)其具有抑制作用，其中50 mg/L NiSO4 處理與對(duì)照差異顯著（P<0.05）。當(dāng)NiSO4 濃度在10～50 mg/L之間時(shí)，堿性磷酸酶活性逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)其濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，其活性反而減弱了。酶活性的增強(qiáng)，說明前期對(duì)酶有促進(jìn)作用；后期酶活性開始減弱，表示其對(duì)酶出現(xiàn)了抑制作用（P<0.01）。表2鎳對(duì)鯽魚腸中酶活性的影響

3結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，鯽魚肝胰臟中脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性在低濃度NiSO4中有所增強(qiáng)，但隨著NiSO4濃度的增加，幾種酶的活性明顯減弱；堿性磷酸酶則一直呈減弱趨勢(shì)?？梢姡陂L(zhǎng)時(shí)間的高濃度NiSO4 脅迫下，鯽魚與植物、哺乳動(dòng)物[4]類似，其脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性受到了抑制，而堿性磷酸酶活性對(duì)NiSO4的影響具有不同的反應(yīng)，其生理機(jī)制還有待于從酶活性調(diào)控的分子水平上進(jìn)行更深入的研究。本研究中的各種酶活性與NiSO4濃度升高的關(guān)系同賈秀英進(jìn)行的鉛對(duì)鯉魚的研究結(jié)果[5]一致，脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性隨時(shí)間變化規(guī)律與黃雪琴等的結(jié)果[6]一致，隨著中毒時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性有所減弱。

魚類肝胰臟是重要的解毒器官，也是主要蓄積重金屬的部位，重金屬離子可以誘導(dǎo)肝胰臟產(chǎn)生金屬硫蛋白[7]，從而降低重金屬的毒性，減少對(duì)肝胰臟的損害，但是隨重金屬離子濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，這種損害會(huì)超過金屬硫蛋白解毒的能力，從而抑制肝胰臟的代謝酶活性。本研究結(jié)果表明，肝胰臟中脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性在高濃度NiSO4脅迫下明顯減弱，說明高濃度NiSO4超出了肝胰臟本身的解毒能力，極大地抑制了脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶的活性。Glzar等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度鉛會(huì)明顯抑制羅非魚堿性磷酸酶活性[8]，本試驗(yàn)結(jié)果與其相似；孔祥會(huì)等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度汞會(huì)明顯抑制肝胰臟堿性磷酸酶活性[4]。

腸為魚類重要的消化器官，腸道的健康、酶的工作狀態(tài)都關(guān)系到魚的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。腸道是魚類疾病傳染的重要途徑之一，腸道功能的下降會(huì)導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體的健康水平下降，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力也會(huì)下降，使大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流入水體，造成整個(gè)水體的健康水平下降，使魚類的傳染病經(jīng)常發(fā)生，嚴(yán)重影響魚類的生存，對(duì)整個(gè)魚類養(yǎng)殖具有嚴(yán)重的破環(huán)作用。

脂肪酶和胰蛋白酶為腸中重要的消化酶，脂肪酶活性的減弱對(duì)整個(gè)機(jī)體的影響是巨大的。脂肪酶是魚腸中重要的消化酶，對(duì)魚類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收有至關(guān)重要的作用[9-11]。ACP和AKP在蛋白（酶）的去磷化過程中起了很大的作用，在生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收消化和運(yùn)輸[12]中也起重要作用，此外還是生物體內(nèi)重要的解毒體系[13]。研究Ni2+對(duì)脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的影響，有助于了解Ni2+對(duì)鯽魚腸中酶以及鯽魚生長(zhǎng)發(fā)育的影響，可作為水源鎳污染監(jiān)測(cè)的一種生物學(xué)指標(biāo)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，鯽魚腸中胰蛋白酶、脂肪酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的活性都隨著NiSO4濃度的增加而呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。當(dāng)NiSO4濃度為0～50 mg/L時(shí)，胰蛋白酶、脂肪酶、堿性和酸性磷酸酶均呈增強(qiáng)趨勢(shì)，說明該濃度的NiSO4對(duì)酶具有激活作用；但當(dāng)NiSO4 濃度為50～100 mg/L時(shí)，各酶的活性則呈減弱的趨勢(shì)，表明對(duì)各酶的活性產(chǎn)生了抑制作用。還有其他類似的試驗(yàn)均得出了“酶活性隨著濃度的增加呈先增強(qiáng)后減弱”的結(jié)論，例如，NiSO4對(duì)大鼠心肝腎 ATPase毒性的試驗(yàn)研究[14]、鉛對(duì)鯽魚酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的影響[7]、鎳及其化合物對(duì)人和動(dòng)物的毒性作用[15]、重金屬Cd脅迫對(duì)紅樹蜆的抗氧化酶、消化酶活性和MDA含量影響[16]等。由此可見，低濃度 NiSO4 對(duì)胰蛋白酶、脂肪酶、ACP和AKP具有不同程度的激活作用，高濃度 NiSO4 對(duì)其具有抑制作用。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)可知，可能是因?yàn)榈蜐舛萅iSO4 會(huì)改變酶的分子結(jié)構(gòu)，使酶活性增強(qiáng)；高濃度NiSO4 會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)，使酶的活性受到抑制。其中，NiSO4 對(duì)脂肪酶、胰蛋白酶和AKP的影響極顯著（P<0.01），對(duì)其的毒性作用很大；對(duì)酸性磷酸酶的影響較小。目前還沒有人研究過鎳對(duì)鯽魚腸胰蛋白酶、脂肪酶、ACP和AKP的影響，因此筆者通過研究 NiSO4 對(duì)鯽魚腸酶的影響，以期為鯽魚的養(yǎng)殖和保護(hù)以及水域的污染狀況提供更多的資料。

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