李天芝，于新友，沈志強(qiáng)，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

豬圓環(huán)病疫苗的研究進(jìn)展

李天芝1，于新友1，沈志強(qiáng)1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus，PCV)是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、動(dòng)物圓環(huán)病毒屬的成員。該病毒科是國際病毒分類委員會(huì)(ICTV)第6次學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)新命名的一個(gè)科，是已知能自行復(fù)制的最小的哺乳動(dòng)物病毒。PCV可以分為PCV1和PCV2兩種血清型。PCV1無致病性，但廣泛存在豬體內(nèi)及豬源代細(xì)胞系，1974年，Tischer首次從PK-15豬腎傳代細(xì)胞系中分離。PCV2具有致病性，該病主要以進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征，可引起斷奶豬和育肥豬生長緩慢、呼吸急迫、消瘦、貧血、出現(xiàn)黃疸現(xiàn)象，剖檢后發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)腫大、肝硬變、多灶性黏液性氣管炎、間質(zhì)性肺炎和腎炎，給養(yǎng)豬業(yè)造相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1991年，在加拿大首次暴發(fā)該病，隨后，世界各國家和地區(qū)都有該病的報(bào)道，并在患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(Porcine Dermatitisand Nephropathy Syndrome，PDNS)等病豬體內(nèi)分離到PCV2，并證明PCV2與這些嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的疾病密切相關(guān)。目前該病毒引起了國內(nèi)外獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。

1 流行特點(diǎn)

豬是PCV2的天然宿主，各種年齡、不同性別的豬都可感染病毒，但以哺乳期和育成期的豬最易感，尤其是5～12周齡的仔豬，一般于斷奶后2～3天開始發(fā)病，急性發(fā)病豬群中，病死率可達(dá)10%，在疾病流行感染過的豬群中，發(fā)病率和死亡率都較低，如果并發(fā)或繼發(fā)細(xì)菌或病毒感染可使死亡率大大增加。豬皮炎與腎病綜合征一般為散發(fā)，豬只在斷奶后2～3天發(fā)病，不發(fā)燒或者輕微發(fā)燒，精神沉郁，會(huì)陰部、腹部皮下水腫，滲出性皮炎，腎臟極度腫大，病程短，多數(shù)在發(fā)病后三天內(nèi)死亡。雖然許多國家和地區(qū)的豬群中存在豬II型圓環(huán)病毒(PCV2)和由它引發(fā)的疾病，但是各國的流行狀況之間存在很大差異。加拿大是首次報(bào)道PMWS的國家，但時(shí)至今日，多數(shù)農(nóng)場的豬群中仍然只是散發(fā)，很少呈流行性發(fā)生PMWS，但是與PCV2有關(guān)的PNDS、心肌炎和繁殖障礙綜合征等疾病正引起了人們更多的關(guān)注。

2 疫苗研究進(jìn)展

2.1 滅活疫苗

采用人工培養(yǎng)大量繁殖免疫原性好的病原微生物，滅活、濃縮后按一定比例加入佐劑制成的疫苗，稱為滅活疫苗，該疫苗可由病原微生物的完整個(gè)體組成，也可由其某些片段組成。滅活疫苗具有無毒、無害、效果穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)。國、內(nèi)外對(duì)豬圓環(huán)病毒滅活疫苗的研究已取得了巨大進(jìn)展。法國梅利亞公司研究、開發(fā)的PCV2油包水乳劑滅活疫苗，在歐洲一些國家已注冊(cè)上市，免疫后備母豬或經(jīng)產(chǎn)母豬，仔豬可通過母源抗體獲得保護(hù)，實(shí)驗(yàn)和臨床證明，該疫苗有較好的效果，可減少感染、排毒，減輕臨床癥狀。國內(nèi)現(xiàn)有3種自主研發(fā)的豬圓環(huán)病毒常規(guī)滅活疫苗獲準(zhǔn)生產(chǎn)上市，其中PCV2滅活疫苗LG株由哈爾濱獸醫(yī)研究所研制，該產(chǎn)品免疫應(yīng)答快，效果好。另有南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的PCV2滅活疫苗SH株和北京大北農(nóng)集團(tuán)研制的PCV2滅活疫苗DBN-SX07株。

2.2 弱毒疫苗

采用抗原性好的無毒株、天然弱毒株或人工誘變的弱毒株制成的疫苗稱為弱毒疫苗，該類疫苗具有不少優(yōu)點(diǎn)如接種數(shù)量少，可刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫，免疫效果好等，但也存在一些缺點(diǎn)如可能會(huì)發(fā)生毒力返強(qiáng)，儲(chǔ)存和運(yùn)輸需在冷凍條件下，易失活，易被細(xì)菌污染等。Fenaux等將PCV2于PK-15細(xì)胞上傳120代，結(jié)果120代病毒比初代病毒滴度高出一個(gè)log單位，同時(shí)，傳30代后Cap基因110位脯氨酸變?yōu)楸彼?P110A)并維持到120代，此外191位精氨酸變?yōu)榻z氨酸(R191S)，突變毒株在豬體內(nèi)的接種實(shí)驗(yàn)表明，PCV2120代病毒血癥時(shí)間和豬血清病毒含量明顯低于第1代，即PCV2120代明顯致弱。也有人將PCV2的ORF2克隆到缺失ORF2的PCV1的骨架中，得到PCV1-2嵌合型病毒。研究表明，該嵌合型病毒是減毒的，能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，可作為制備PCV弱毒疫苗的優(yōu)勢(shì)毒株，且具備不易發(fā)生毒力返強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

2.3 亞單位疫苗

只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的一類疫苗，稱為亞單位疫苗。Zhou等首次在大腸桿菌中對(duì)缺失了核定位信號(hào)序列(NLS)的PCV2 cap蛋白(dCap)與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)進(jìn)行了融合表達(dá)，獲得了rGST-dCap蛋白，實(shí)驗(yàn)證明，純化的rGST-dCap蛋白以及去掉GST的rdCap蛋白，均可與抗PCV2豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)。用rdCap蛋白制備的單抗，可與感染PK15細(xì)胞的病毒粒子以及在PK15細(xì)胞中表達(dá)的Cap蛋白發(fā)生反應(yīng)，同時(shí)表現(xiàn)對(duì)PCV2病毒粒子的中和活性。付玉潔等為評(píng)價(jià)豬圓環(huán)病毒(PCV)2a/2b兩種基因型病毒株及其重組Cap蛋白 (rCap)之間的交互免疫，采用重組桿狀病毒表達(dá)的2種Cap蛋白(PCV2a-rCap和PCV2b-rCap)亞單位疫苗。免疫小鼠后進(jìn)行攻毒，結(jié)果，以PCV2a和PCV2b各為指示病毒對(duì)病毒抗血清和rCap蛋白抗血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，同型病毒株與同型血清的中和抗體效價(jià)均高于異型病毒株。病理觀察顯示，免疫鼠均未見明顯病理變化，攻毒對(duì)照鼠肺臟出現(xiàn)一定程度的病理損傷。劉丹等以重組桿狀病毒表達(dá)的重組PCV2-Cap蛋白制備亞單位疫苗，免疫BALB/c鼠測定其抗體、中和抗體。結(jié)果表明，該蛋白亞單位疫苗能夠提供良好的免疫保護(hù)效果，能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的體液免疫應(yīng)答。

2.4 核酸疫苗

構(gòu)建含有外源抗原基因的重組質(zhì)粒，免疫動(dòng)物后，表達(dá)的特異性抗原蛋白通過與MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類抗原分子結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，該類疫苗稱為核酸疫苗，又名DNA疫苗。Kamstrup等為了進(jìn)一步探索衣殼蛋白免疫預(yù)防的適用性，采用了pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表達(dá)載體克隆了PCV2的ORF2基因，并證實(shí)了此質(zhì)粒能夠在體外(通過直接表達(dá)蛋白)以及體內(nèi)(通過對(duì)小鼠用基因槍注射質(zhì)粒，誘導(dǎo)小鼠免疫產(chǎn)生抗體)進(jìn)行表達(dá)。免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，所構(gòu)建的核酸疫苗均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。金寧一等以pVAX1為載體，構(gòu)建了表達(dá)PCV2 ORF1、ORF2和豬IL-18的核酸疫苗 pVAX1-ORF2、pVAX1-IL18-ORF2、pVAX1-ORF2-ORF1、pVAX1-IL18-ORF2-ORF1等。用這些核酸疫苗免疫6～8周齡小鼠，結(jié)果表明，所構(gòu)建的核酸疫苗均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中核酸疫苗pVAX1-IL18-ORF2-ORF1免疫效果優(yōu)于其他幾種疫苗。宋云峰等將ORF2基因克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建了pc-ORF2作為核酸疫苗免疫小鼠。同時(shí)將具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的BVP22基因分別克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表達(dá)，肌肉注射免疫接種Balb/c小鼠，結(jié)果顯示，通過兩次免疫后，各疫苗組均產(chǎn)生了針對(duì)ORF2的體液抗體，同時(shí)證明BVP22可增強(qiáng)核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好，為防控豬圓環(huán)病毒II型感染提供了較為理想的侯選疫苗。BlanchardP等研究了PCV2基因疫苗及亞單位苗的免疫效力，仔豬用ORF2和 GM-CSF表達(dá)質(zhì)粒首免，2周后用ORF2和GM-CSF表達(dá)質(zhì)粒以及ORF2蛋白二免，免疫豬可抵抗PCV2的攻擊，表明ORF2可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)。但通過比較，單獨(dú)用PCV2基因疫苗兩次免疫的效果低于亞單位苗的效果，不能完全抑制PCV2的增殖。Aravindaram等用構(gòu)建的含PCV2 ORFl、ORF2、ORF3的3種重組質(zhì)粒單獨(dú)或聯(lián)合免疫小鼠，2周后加強(qiáng)免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF2/3與ORFl/2/3這2種質(zhì)粒組合免疫后PCV2病毒載量顯著減少，誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF以及PCV2抗體水平均高于其他免疫組，小鼠的肺部病變也明顯減輕。史小紅等將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-ORF1-ORF2免疫小鼠，2周后加強(qiáng)免疫，同時(shí)設(shè)置pcDNA-ORF1、pcDNA-ORF2、pcDNA3.1-(+)、PCV2全毒疫苗和PBS對(duì)照。結(jié)果表明，該重組質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2抗體水平與其他試驗(yàn)組相比差異顯著。閆若潛等將豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）ORF2/豬白介素-2(PoIL-2)嵌合重組表達(dá)質(zhì)粒 (rpcDNA3.1/PCV2-1inker-PoIL-2)免疫10日齡健康仔豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒對(duì)豬體的免疫和免疫保護(hù)效果顯著。

2.5 活載體疫苗

采用弱毒或無毒病原微生物作為表達(dá)載體，對(duì)其導(dǎo)入外源抗原基因，制成疫苗后，接種動(dòng)物，誘導(dǎo)機(jī)休產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，這類新型疫苗稱為活載體疫苗。Wang等將PCV2 ORF2克隆入 E.coli/L.lac分泌型穿梭表達(dá)載體 pSEC: LEISS，構(gòu)建了重組穿梭載體pSEC:LEISS-dCap，電轉(zhuǎn)化乳酸菌NZ9000，獲得能有效表達(dá)Cap蛋白的重組乳酸桿菌，將該菌培養(yǎng)液經(jīng)口灌喂對(duì)Balb/c小鼠的生長發(fā)育沒有影響，無毒性作用，能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抗Cap蛋白的特異性IgG抗體，刺激腸道黏膜淋巴組織對(duì)其產(chǎn)生黏膜免疫。Kim等將PCV2的ORF2克隆至aroA突變的支氣管炎博德特氏菌獲得表達(dá)主要衣殼蛋白的重組博德特氏菌(BBS-MCP)，然后用重組細(xì)菌鼻內(nèi)免疫豬，用PCV2攻毒后，在活BBS-MCP免疫的豬淋巴結(jié)中檢測不到PCV2 DNA，結(jié)果表明BBS-MCP免疫能有效抵抗PCV2的感染，是發(fā)展抗PCV2感染的減毒活疫苗的又一選擇。Ju等用減毒的偽狂犬病病毒(PRV)作為活病毒載體，構(gòu)建了表達(dá)PCV2 ORF1-ORF2的重組病毒PRV-PCV2。試驗(yàn)表明，PRV-PCV2可誘導(dǎo)小鼠和豬產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗PCV2和PRV抗體反應(yīng)，在小鼠中產(chǎn)生針對(duì)PRV的免疫保護(hù)，可抵抗致死量的PRV Ea株的攻擊，表明PRV-PCV2可用于抵抗PCV2和PRV感染。Song等將PCV2 ORF2基因插入pIEC-MV質(zhì)粒，與偽狂犬病毒Tk-/ gE-/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，產(chǎn)生一個(gè)重組的Tk-/gE-/ORF2(+)病毒。將其免疫4周齡的仔豬檢測其免疫原性。結(jié)果表明，該重組病毒能誘導(dǎo)明顯的抗PRV和PCV2體液免疫反應(yīng)，并且在試驗(yàn)的第49天能夠檢測到PCV2特異性的淋巴細(xì)胞增值反應(yīng)。Liu等成功構(gòu)建了融合表達(dá)PCV2 ORF2基因與豬IFN-γ基因的重組腺病毒rAd-ORF2-IFN-γ，并證實(shí)rAd-ORF2-IFN-γ在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2特異性抗體的能力比單獨(dú)表達(dá)Cap蛋白的rAd-ORF2強(qiáng)，表明豬IFN-γ作為細(xì)胞因子佐劑可以顯著增強(qiáng)Cap的免疫原性。Pei等在PRRSV cDNA克隆的ORFs1b與2a插入兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)及一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，將其改造成一個(gè)病毒載體，然后將PCV2 ORF2基因插入兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)間，由插入的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染