謝志葵 陳銳鋒 李國(guó)文

(1 南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院內(nèi)科，廣州市 510900，E－mail:xiezhikui2014@163.com;2 廣東從化市街口街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，廣州市 510900)

結(jié)直腸癌是臨床上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近幾年其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，發(fā)病也呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的臨床癥狀不明顯，且發(fā)展較快，大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，不利于治療，因此盡早準(zhǔn)確診斷結(jié)直腸癌可為治療爭(zhēng)取更多的時(shí)間。目前臨床上診斷結(jié)直腸癌的方法所需時(shí)間較久，費(fèi)用較高，儀器設(shè)備也比較昂貴。建立一種快速且具有高靈敏性的結(jié)直腸癌檢測(cè)方法具有很高的必要性。蛋白質(zhì)組學(xué)是某種生物或某種細(xì)胞在特定時(shí)間表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，為臨床醫(yī)師提供了新的腫瘤早期診斷和預(yù)后評(píng)估的手段［1－4］。本文旨在建立人結(jié)直腸癌血清蛋白標(biāo)記物診斷模型，并分析其診斷直腸癌的效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012 年6 月至2014 年6 月在南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院就診的直腸癌患者119 例(直腸癌組)，均經(jīng)過直腸癌鏡和病理檢查確診，均無其嚴(yán)重的并發(fā)癥，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［5］。其中男65 例，女54 例;年齡25 ～76(45.9±6.7)歲;低分化腺癌53 例，中分化腺癌49 例，黏液腺癌14 例，印戒細(xì)胞癌3 例。術(shù)后病理結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者29 例，其中N1期12 例，N2期17 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(即N0期)患者90 例。均行直腸癌根治手術(shù)治療。同期在南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院體檢健康者127 例為對(duì)照組，其中男69 例，女58 例，年齡28 ～73(44.6±7.2)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，具有可比性。均排除影響血清蛋白質(zhì)含量的其他相關(guān)性疾病。

1.2 儀器與試劑 高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，德國(guó)Thermo 公司);4℃冰箱(中國(guó)海爾公司);－80℃冰箱(德國(guó)西門子公司);微量移液器(法國(guó)Gilson 公司)。血清癌胚抗原(CEA)檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天)，三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)等購自美國(guó)Sigma公司;鼠抗人EHD 家族蛋白2(EHD2)抗體、鼠抗人1－異戊烯半胱氨酸氧化酶(prenylcysteine oxidase1，Pcyox1)抗體、鼠抗人激肽原1(kininogen－1，KING1)抗體、羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體購自美國(guó)Abcam 公司;酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測(cè)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集:采集術(shù)前清晨直腸癌組與對(duì)照組患者空腹靜脈血3 ml，加入適量枸櫞酸鈉抗凝劑，將全血放置在4℃冰箱中1 h，然后4 000 r/min，離心20 min，取血清，置于－80℃冰箱中保存。

1.3.2 液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè):取血清樣品1 μl與10 μl 基質(zhì)α－氰基－4－羥基肉桂酸混勻，取1 μl 混合液點(diǎn)在Anchorchip 靶板(美國(guó)Bruker 公司)上，每個(gè)樣品分別點(diǎn)3 個(gè)靶點(diǎn)以做3 次重復(fù)。室溫干燥后將靶板放入質(zhì)譜儀以線性模式運(yùn)轉(zhuǎn)進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，采用FlexControl 2.0 軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正后開始檢測(cè)樣品，每個(gè)樣品經(jīng)過300 次激光打靶(5 次點(diǎn)靶，每次打靶2×30次)之后生成質(zhì)譜圖譜，獲得有不同質(zhì)核比的蛋白多肽譜圖。應(yīng)用FlexAnalysis 3.0 軟件對(duì)獲得的圖譜進(jìn)行分析。采用ClinProTools 2.1 軟件結(jié)合遺傳算法等生物統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)方法分析兩組血清樣本的蛋白多肽圖譜。進(jìn)行歸一化平滑處理總離子流圖，消除化學(xué)及電物理噪聲;分析組間差異蛋白并計(jì)算差異大小，按差異大小由大到小排列;應(yīng)用遺傳算法對(duì)各差異蛋白的敏感性及特異性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，建立判別模型并驗(yàn)證，找出組間具有顯著差異的蛋白多肽峰值。

1.3.3 使用ELISA 方法檢測(cè)患者血清蛋白標(biāo)志物的水平:選擇血清中表達(dá)有差異的蛋白標(biāo)記物，使用ELISA方法檢測(cè)兩組血清中蛋白標(biāo)志物的水平。包被完之后進(jìn)行封閉，加入待檢血清，然后加入兔抗人一抗，再加入HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗，進(jìn)行顯色，終止顯色之后放入酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)讀數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用非條件logistic 回歸分析，繪制受試者工作特征(ROC)曲線，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果 多因素非條件logistic 回歸分析，EHD2、Pcyox1 及KING1 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。將其作為診斷模型中的變量，建立直腸癌血清多肽譜診斷模型 p =1 ÷［1 +e－(0.002EHD2+0.006Pcyox1+0.003KING1)］。各多肽單獨(dú)診斷直腸癌的判斷標(biāo)準(zhǔn):EHD2 ＞100 μg/ml 診斷為直腸癌，≤100 μg/ml時(shí)診斷為正常;KING1 ＞161.69 μg/ml 時(shí)診斷為直腸癌，≤161.69 μg/ml 時(shí)診斷為正常;Pcyox1 ＞99.3 μg/ml 時(shí)診斷為直腸癌，≤99.3 μg/ml 時(shí)診斷為正常。以病理檢查為“金標(biāo)準(zhǔn)”，KING1 診斷直腸癌的靈敏性、準(zhǔn)確率和特異性較高，Pcyox1 的檢測(cè)靈敏性、準(zhǔn)確率和特異性最低。血清多肽譜診斷模型診斷直腸癌的靈敏性、準(zhǔn)確率及特異性分別為82.3%、87.4%及92.1%，見表2。血清多肽譜診斷模型診斷直腸癌的ROC 曲線面積為0.892%，見圖1。

表1 多因素非條件logistic 回歸分析結(jié)果

表2 EHD2、Pcyox1、KING1 和診斷模型診斷直腸癌的效果

圖1 EHD2、Pcyox1、KING1 診斷直腸癌的ROC 曲線

2.2 直腸癌組與對(duì)照組血清EHD2、Pcyox1、KING1 的表達(dá)水平比較 直腸癌組EHD2、KING1 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)，Pcyox1 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P ＜0.05)。見表3。

表3 直腸癌組與對(duì)照組血清EHD2、Pcyox1、KING1 表達(dá)水平比較(，μg/ml)

表3 直腸癌組與對(duì)照組血清EHD2、Pcyox1、KING1 表達(dá)水平比較(，μg/ml)

組別 n EHD2 Pcyox1 KING1直腸癌組119 9.87±3.55 2.54±0.87 6.22±2.51對(duì)照組 127 4.92±2.14 3.62±1.04 4.38±1.67 t 值 2.583 1.987 2.144 P 值0.014 0.041 0.037

3 討 論

在西方國(guó)家，結(jié)直腸癌發(fā)病率及致死率在所有癌癥中分別居第二位和第三位［6］，近年我國(guó)直腸癌發(fā)病率呈明顯遞增趨勢(shì)［7－8］。結(jié)直腸癌患者的存活率往往與其臨床診斷時(shí)腫瘤的發(fā)展程度有明顯關(guān)系。結(jié)直腸癌屬于誤漏率較高的一類腫瘤，其誤漏診率高達(dá)30%，且早期結(jié)直腸癌的檢出率不超過0.5%［9－11］。這可能與以下幾個(gè)方面有緊密的聯(lián)系:(1)結(jié)直腸癌的相關(guān)知識(shí)并未在普通大眾中普及，群眾就醫(yī)不及時(shí);(2)醫(yī)生往往只注重臨床表現(xiàn)，對(duì)癥治療以緩解患者癥狀，未深究病因，導(dǎo)致誤、漏診;(3)并發(fā)痔瘡、消化道出血等的患者更易被誤診漏診;(4)臨床隨訪無針對(duì)性或隨訪周期不足;(5)診斷方式單一、復(fù)雜且昂貴;(6)不重視對(duì)結(jié)直腸癌的早期普查。

差異蛋白質(zhì)組學(xué)的核心是尋找某種特定因素引起樣本之間蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，揭示并驗(yàn)證表達(dá)差異的蛋白質(zhì)譜在生理或病理過程中的變化。進(jìn)一步對(duì)蛋白質(zhì)組差異信息分析后，理論上可以推斷造成這種變化的原因?，F(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)如雙向電泳技術(shù)、固體蛋白芯片、傅立葉變換質(zhì)譜技術(shù)、蛋白指紋技術(shù)，又稱為表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜等［12－14］，給臨床腫瘤早期標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)帶來了劃時(shí)代的意義，其將傳統(tǒng)的通常每次只能測(cè)定一個(gè)蛋白標(biāo)志物革命性地發(fā)展為每次可測(cè)定數(shù)十個(gè)，甚至數(shù)百個(gè)蛋白，同時(shí)極大地提高了診斷的靈敏性和特異性。本文結(jié)果顯示，直腸癌組EHD2、KING1 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)，Pcyox1 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P ＜0.05)，提示EHD2、Pcyox1、KING1 蛋白與直腸癌的發(fā)生存在一定的關(guān)系。我們認(rèn)為直腸組患者血清KING1 水平升高有可能與肝臟本身的功能變化有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)告KING1 由肝臟分泌，因此其表達(dá)升高很可能與肝細(xì)胞的合成增加有關(guān)［14］。本文多因素非條件logistic 回歸篩選出EHD2、Pcyox1及KING1 作為診斷模型中的變量，建立血清多肽譜診斷模型。該血清多肽譜診斷模型診斷直腸癌具有較高的靈敏性、準(zhǔn)確率及特異性，分別為82.3%、87.4%及92.1%，且ROC 曲線面積為89.2%。雖然血清多肽譜診斷模型與KING1 單獨(dú)診斷直腸癌比較，靈敏性、準(zhǔn)確率稍低，但特異性好。

綜上所述，直腸癌血清多肽譜診斷模型診斷直腸癌的靈敏性、準(zhǔn)確率均較高，特異性好，用于臨床診斷直腸癌具有一定的價(jià)值。

［1］ 湯釗猷.現(xiàn)代腫瘤學(xué)［M］.第2 版.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社，2000:125.

［2］ 張亞歷.大腸癌的基礎(chǔ)與臨床［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1999:353.

［3］ Lawrie LC，Curran S，Mcleod HL，et al.Application of laser capture microdissection and proteomics in colon cancer［J］.Mol Pathol，2001，54(4):253－258.

［4］ Wu W，Hu W，Kavanagh JJ.Proteomics in cancer research［J］.Int J Gynecol Cancer，2002，12(5):409－423.

［5］ 郝希山，魏于全.腫瘤學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:151－153.

［6］ Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistic，2010［J］.CA Cancer J Clin，2010，60(5):277－300.

［7］ 王繼恒，李世榮.我國(guó)結(jié)直腸癌篩查和早期診斷十年回顧:1994 ～2005［J］.胃腸病學(xué)，2006，11(4):245－250.

［8］ 邱培林，鄭 樹，吳金民，等.纖維乙狀結(jié)腸鏡在大腸癌普查中的應(yīng)用價(jià)值(附3 359 例檢查結(jié)果分析)［J］.中國(guó)內(nèi)鏡雜志，1997，3(1):51－52.

［9］ 蔡善榮，鄭 樹，周 倫，等.杭州城市社區(qū)自然人群大腸癌篩查實(shí)踐［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2006，21(2):177－178.

［10］陳昌貴，張 濤，吳 毅，等.城市社區(qū)居民大腸癌篩查順應(yīng)性影響因素的病例對(duì)照研究［J］.中華醫(yī)院管理雜志，2010，26(4):311－314.

［11］劉希永，鄭 樹，楊 工，等.結(jié)直腸癌篩檢優(yōu)化方案在高危人群中應(yīng)用評(píng)價(jià)［J］.腫瘤防治研究，1997，24(4):197－199.

［12］李 甜，諶宏鳴.應(yīng)用液體蛋白芯片－飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)從血清中篩選胃癌腫瘤標(biāo)志蛋白［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17(8):1 513－1 515.

［13］于新哲，許劍民.應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)早期診斷結(jié)直腸癌及肝轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展［J］.中華胃腸外科雜志，2010，13(8):634－636.

［14］李 莉，諶宏鳴，李 甜，等.應(yīng)用液體蛋白芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)研究胃癌、肝癌血清差異蛋白表達(dá)［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30(8):733－737.