李 楠 賀豐杰 李小寧 朱虹麗 陳 梅

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，咸陽市 712000，E－mail:linan_80_311@163.com)

迄今為止子宮肌瘤發(fā)生的確切病因尚未明了，但雌、孕激素在其發(fā)生過程中的作用已得到廣泛認(rèn)可。有研究表明雌孕激素通過介導(dǎo)局部血管生長因子調(diào)控血管通透性及血管生成來促進肌瘤的生長并導(dǎo)致臨床癥狀的出現(xiàn)［1－6］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是主要的血管生成促進因子，在子宮肌瘤組織的血管生成中起著核心作用。筆者前期實驗已證實宮瘤消膠囊能夠調(diào)節(jié)雌、孕激素水平，影響靶器官中雌激素受體、孕激素受體的含量，抑制靶細(xì)胞對性激素的反應(yīng)。目前，宮瘤消膠囊發(fā)揮抑瘤、縮瘤及預(yù)防復(fù)發(fā)的作用是否與調(diào)控VEGF 及其受體的表達(dá)有關(guān)尚無定論。本文旨在探討宮瘤消膠囊對子宮肌瘤模型大鼠VEGF 及其受體表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物

1.1.1 藥物與試劑:宮瘤消膠囊［山東步長神州制藥，批號131107;組成:牡蠣、香附(制)、三棱、莪術(shù)、土鱉蟲、仙鶴草、黨參、白術(shù)、白花蛇舌草、牡丹皮、吳茱萸;規(guī)格0.5 g/粒，20 粒/板，3 板/盒］、桂枝茯苓膠囊(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號:130907;組成:桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍;規(guī)格:0.31 g/粒，10 粒/板，6 板/盒)、苯甲酸雌二醇(赤峰博恩藥業(yè)，批號140201;規(guī)格:4 mg×10 支)、黃體酮注射液(浙江仙琚制藥，批號140116.1;規(guī)格1 ml:20 mg×10支);VEGF、VEGF 受體1(vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR1)、VEGF 受 體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)單克隆抗體(批號:bs－1665R，bs－1774R，bs－1932R)，購自博奧斯公司;聚偏二氟乙烯膜、辣根過氧化酶標(biāo)記二抗(K－5007)購自Dako公司;二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自凱基公司。

1.1.2 實驗動物:清潔級雌性SD 大鼠60 只，未經(jīng)生育交配，體重(200.0±20.0)g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，合格證號:SCXK(軍)2012－0007。飼養(yǎng)環(huán)境:陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實驗室，室溫(20.0±2.0)℃，動物自由攝食、飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠子宮肌瘤模型的建立與分組:大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、桂枝茯苓組和宮瘤消小劑量、中劑量、大劑量組，每組10只。模型組、桂枝茯苓組和宮瘤消小劑量、中劑量、大劑量組腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，連續(xù)25 d，后改為腹腔注射黃體酮注射液4 mg/kg，連續(xù)5 d，即可建立子宮肌瘤模型。正常對照組腹腔內(nèi)注射滅菌花生油0.5 mg/kg，連續(xù)30 d。

1.2.2 處理方法:正常對照組和模型組每日灌以生理鹽水，10 ml/kg，各組均1 次/d。宮瘤消膠囊成人用量為0.5 g/粒，每日3 次，每次4 粒;桂枝茯苓膠囊成人用量為0.31 g/粒，每日3 次，每次3 粒。桂枝茯苓膠囊組按照70 kg 體重成人與大鼠體表面積折算的等效劑量，大鼠的等效劑量相當(dāng)于成人的6.3 倍，0.25 g/kg 為該組每只大鼠每日灌胃總生藥量，以10 ml/kg的標(biāo)準(zhǔn)計算出每只大鼠每日灌胃總體積，以此體積的生理鹽水溶解總生藥。宮瘤消小劑量組:按照上述方法，計算出0.54 g/kg 為每日總劑量，相當(dāng)于臨床劑量。宮瘤消中劑量組:按照上述方法，計算出1.35 g/kg 為每日總劑量，相當(dāng)于臨床劑量的2.5 倍。宮瘤消大劑量組:按照上述方法，給予宮瘤消膠囊劑量3.38 g/kg 為每日總劑量，相當(dāng)于臨床劑量的6.25 倍。造模結(jié)束后2 d，開始灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)4周。各組大鼠于灌胃給藥干預(yù)后第4 周末分別脫臼處死動物，進行相關(guān)檢測。

1.2.3 子宮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察:處死大鼠后，剖腹沿子宮膀胱連接處剪取子宮，剝離洗凈，在子宮最膨大處取0.5 ～1.0 mm3大小子宮平滑肌，1%鋨酸固定2 h，逐級酒精脫水，將標(biāo)本置于2%的乙酸異戊酯中3 h，干燥，采用電子顯微鏡(日立H－7650)觀察子宮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 Western Blot 法 檢 測 子 宮 平 滑 肌 VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達(dá):子宮病理組織取材后，從子宮根部選取一段新鮮病變組織0.5 ～1.0 mm3(正常對照組取子宮相同部位等量正常組織)。將組織標(biāo)本剪碎，經(jīng)預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌2 次，加入1 ml 總蛋白質(zhì)提取液，勻漿，振搖冰浴30 min，應(yīng)用低溫高速離心機，保持4℃，15 000 r/min 離心20 min，將上清液吸出后置入干凈環(huán)氧樹脂管，－30℃保存。取50 μl 上清液按BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白含量。樣品煮沸3 min。取50 μg 總蛋白的樣品液，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳;電泳完成后進行電轉(zhuǎn)膜;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后進行膜封閉和一抗、二抗孵育。聚偏二氟乙烯膜通過電化學(xué)發(fā)光法顯色，最后曝光于X 膠片上，常規(guī)顯影、定影。內(nèi)參照為鼠抗人甘油三磷酸脫氫酶單抗(1 ∶5 000)。結(jié)果掃描保存至電腦，經(jīng)采用Quantity One 軟件進行對特異蛋白條帶進行灰度掃描和定量分析處理，得出相對光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠子宮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 正常對照組子宮平滑肌細(xì)胞排列整齊，呈梭形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器正常，相鄰細(xì)胞連接緊密，細(xì)胞周圍膠原纖維排列規(guī)則，見圖1。模型組子宮肌瘤細(xì)胞顯著增生，體積增大;細(xì)胞核近似橢圓形，核體積增大，核仁較大;細(xì)胞內(nèi)含有較豐富的肌微絲，線粒體增生，數(shù)目增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張;細(xì)胞周圍可見大量增生、排列不規(guī)則的膠原纖維，見圖2。桂枝茯苓組細(xì)胞排列稀疏，輕度增生，核質(zhì)比例失調(diào)，細(xì)胞器減少，胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度肥大增生，可見少量核糖體和擴張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞周圍膠原纖維紊亂、堆積，見圖3。宮瘤消小劑量組細(xì)胞排列較稀疏，輕度增生，肌微絲不豐富，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少，線粒體和擴張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少，部分線粒體呈空泡樣改變，細(xì)胞周圍膠原纖維度輕度增生、排列紊亂，見圖4。宮瘤消中劑量組細(xì)胞排列基本正常，體積略縮小，肌微絲較豐富，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器增多，見線粒體和擴張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，部分線粒體呈空泡樣改變，空泡較多，細(xì)胞周圍膠原纖維增生不明顯、排列較規(guī)則，見圖5。宮瘤消大劑量組細(xì)胞排列基本正常，體積縮小，部分核固縮，染色質(zhì)邊集;細(xì)胞器基本接近正常，肌微絲含量較少，線粒體數(shù)目減少;膠原纖維增生不明顯，排列基本規(guī)則，見圖6。

2.2 各組大鼠子宮平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達(dá)情況 各組大鼠子宮平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。除宮瘤消大劑量組VEGFR2 表達(dá)水平均高于正常對照組(P ＞0.05)外，模型組、桂枝茯苓組及宮瘤消各劑量組VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達(dá)水平均高于正常對照組(P ＜0.05)。與模型組比較，宮瘤消小劑量組VEGFR2與之比較僅有下降趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，宮瘤消各劑量組VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達(dá)水平均明顯低于模型組(P ＜0.05)。桂枝茯苓組除了VEGFR2的表達(dá)水平低于模型組(P ＜0.05)外，VEGF、VEGFR1的表達(dá)水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。宮瘤消小劑量組VEGFR2 的表達(dá)水平與桂枝茯苓膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，各劑量宮瘤消組VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達(dá)水平均明顯低于桂枝茯苓組(P ＜0.05)。見表1。

圖1 正常對照組子宮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(×8 000)

圖2 模型組子宮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(×8 000)

圖3 桂枝茯苓膠囊組子宮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(×8 000)

圖4 宮瘤消小劑量組子宮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(×8 000)

圖5 宮瘤消中劑量組子宮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(×8 000)

圖6 宮瘤消大劑量組子宮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(×8 000)

表1 各組大鼠子宮平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達(dá)情況，ng/L)

表1 各組大鼠子宮平滑肌VEGF、VEGFR1、VEGFR2 的表達(dá)情況，ng/L)

注:與正常對照組比較，#P ＜0.01，與模型組比較，*P ＜0.01。

組別 nVEGF VEGFR1 VEGFR2宮宮宮正 桂瘤瘤瘤常模枝消消消對型茯小中大照組苓劑劑劑組 組量量量 組組組 111111 000000 000 00 0.....321.440167 60 9±±±±±±000 00 0.....000.000745 41 3###***##000 00 0.....321.440298 00 9±±±±±±000 00 0.....000.00864 0619#####*** 00 000 0.....1.1 3337 0 0 846 8±±±±±±00 000 0.....0.0 000 0 12 616 1#*###*F 值 204.053 40.898 140.419 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討 論

子宮肌瘤為女性生殖系統(tǒng)最常見的良性實體腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的過程，其病因錯綜復(fù)雜，涉及種族、性激素、生長因子、癌基因等多個環(huán)節(jié)。雖然病因尚未明確，但目前已公認(rèn)子宮肌瘤是性激素依賴性腫瘤，雌激素、孕激素與其受體之間的相互作用是子宮肌瘤生長的基礎(chǔ)和促進因素。因此，本研究采用外源性雌孕激素負(fù)荷法制造大鼠子宮肌瘤動物模型。通過電鏡觀察到正常對照組大鼠子宮平滑肌細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器正常，膠原纖維排列規(guī)則;模型組大鼠子宮平滑肌細(xì)胞增生、體積增大，細(xì)胞內(nèi)有豐富的肌微絲，細(xì)胞器數(shù)量增多，膠原纖維增生紊亂，提示模型組大鼠子宮肌層病理變化與人子宮肌瘤病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)類似，證實了模型復(fù)制成功。在給予不同劑量宮瘤消膠囊治療后，病理學(xué)結(jié)果顯示，平滑肌細(xì)胞的異常增殖受到抑制，部分膠原纖維的紊亂堆積情況得到逆轉(zhuǎn)。提示宮瘤消膠囊能有效改善雌、孕激素負(fù)荷大鼠子宮組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。

足夠的血流供應(yīng)及血管生成是腫瘤生長的必要條件，子宮肌瘤的生長同樣需要豐富的血供及血管形成。在各種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)VEGF 的存在，無論是在體內(nèi)還是體外研究中，VEGF 均被證實參與了腫瘤血管生成活動。VEGFR1 與VEGFR2 作為與VEGF 特異性結(jié)合的受體，是受體酪氨酸激酶家族中的主要成員，兩者與配體結(jié)合后能促進內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生及新生血管的形成，增加血管通透性，促進可溶解血管基底膜和間質(zhì)纖維酶的表達(dá)，有利于新生血管的生長［7］。

在既往的研究中，有關(guān)VEGF 及其受體在子宮肌瘤發(fā)生中的作用報告較少。Harrison－Woolrych 等［8］通過PCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)瘤體平滑肌細(xì)胞中有VEGF mRNA 及VEGF 肽表達(dá)。隨后Hague 等［9］通過試驗將VEGF 表達(dá)進行定位，發(fā)現(xiàn)在子宮肌瘤瘤體的內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞中VEGF 呈現(xiàn)高表達(dá)。此后鐘一村等［10］通過對人子宮肌瘤中VEGF 及其受體表達(dá)的研究，發(fā)現(xiàn)VEGF、VEGFR1 與VEGFR2 蛋白在肌瘤組織中的表達(dá)明顯高于周圍正常肌層組織，并且在整個月經(jīng)期都發(fā)揮著相同的作用，其表達(dá)量與肌瘤數(shù)量呈正相關(guān)。這些研究不但證實了VEGF、VEGFR1 與VEGFR2與肌瘤的發(fā)病密切相關(guān)，也揭示了與肌瘤病變程度的內(nèi)在聯(lián)系。

本文結(jié)果顯示，與模型組比較，除宮瘤消小劑量組VEGFR2 表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)外，宮瘤消各劑量組VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表達(dá)水平均明顯降低(P ＜0.05)，說明宮瘤消膠囊干預(yù)后，VEGFR1 與VEGFR2 的表達(dá)水平與VEGF 同步降低，這提示VEGFR1、VEGFR2 與VEGF 的表達(dá)水平相適應(yīng)，對肌瘤的發(fā)病同樣具有重要作用。這種抑制效應(yīng)提示中藥宮瘤消膠囊抑瘤、縮瘤、預(yù)防復(fù)發(fā)的作用與干擾VEGF/VEGFR 信號系統(tǒng)從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生、新血管形成，降低血管通透性，減少甚至阻斷子宮肌瘤血供，進而使瘤細(xì)胞萎縮或消亡有關(guān)。本文結(jié)果提示，小劑量宮瘤消組的VEGFR2 表達(dá)水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，提示其對VEGFR2 的抑制作用相對微弱，這反映了VEGFR2 的表達(dá)更活躍，可能對肌瘤的生長起到更大的作用，與肌瘤病變程度的內(nèi)在聯(lián)系更緊密。隨著劑量的增加，宮瘤消膠囊對VEGFR2 的表達(dá)水平逐漸表現(xiàn)出顯著的降調(diào)節(jié)效應(yīng)。其中，宮瘤消膠囊大劑量組對VEGFR2 的作用更為突出，數(shù)據(jù)顯示該組的VEGFR2表達(dá)水平接近正常對照組的水平。這為宮瘤消膠囊抑瘤、縮瘤的最低有效劑量的確定提供了參考。

綜上所述，宮瘤消膠囊對子宮肌瘤模型大鼠VEGF及其受體表達(dá)有明顯抑制作用，并能改善子宮肌瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。干擾VEGF/VEGFR 信號系統(tǒng)從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生、新血管形成，降低血管通透性，減少甚至阻斷子宮肌瘤血供，進而使瘤細(xì)胞萎縮或消亡可能是宮瘤消膠囊抑瘤、縮瘤、預(yù)防復(fù)發(fā)的機制之一。

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