張作秀

（格爾木市動物疫病預(yù)防控制中心，青海 格爾木 816099）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是一種常用的固相酶免疫測定方法,是在放射免疫分析理論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性標記免疫技術(shù),具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好 ,所用試劑穩(wěn)定、易保存,試驗操作簡便,結(jié)果判斷客觀等特點[1]。液相阻斷ELISA用于檢測家畜血清中的口蹄疫(FMD)抗體。主要應(yīng)用于兩個方面:一是檢測FMD病毒感染,廣泛用于國際貿(mào)易中；二是監(jiān)測免疫抗體,評價FMD疫苗免疫效果,也就是疫苗免疫動物的抗強毒攻擊能力[2]。液相阻斷ELISA試驗操作雖比正向間接血凝試驗(PHA)繁瑣,但它的精確性、穩(wěn)定性遠遠高于正向間接血凝試驗[1]。

筆者首次利用液相阻斷ELISA試驗檢測牛羊O型口蹄疫免疫效果，檢測牛45頭份，羊45只份，現(xiàn)將檢測結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品

1.1.1 郭勒木德鎮(zhèn)的拖拉海村和阿拉爾生態(tài)畜牧業(yè)合作社分別無菌采集牛血45份，羊血45份，共計牛90份，羊90份。

1.1.2 傾斜試管靜止24h，待血清自然析出，分裝、標記、冷藏保存運送至實驗室。

1.2 器材準備

1.2.1 移液器。0.2～10 uL、5～50 uL、50～200 uL、50～300uL12道移液器各一把；U型微量血凝板18塊。

1.2.2 純水儀制作純凈水。

1.3 試劑

1.3.1 從2℃～8℃冰箱取出口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒回歸室溫（20℃～25℃）30 min。該試劑盒由青海省動物疫病預(yù)防控制中心提供，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，有效期為 6 個月，批號：2014120901-3。

1.3.2 將本試劑盒配備的25倍PBST濃縮液用純凈水稀釋成1倍PBST：按1∶25倍稀釋（1份濃縮液加入24份純凈水進行稀釋）。

1.3.3 底物溶液的配制。取一片檸檬酸-磷酸鹽片劑溶于100mL純凈水中，溶化后，取50mL本溶液，再加一片鄰苯二胺（OPD）片劑，充分溶解，分裝，避光，臨用前加每1mL底物溶液加10uL3%雙氧水。

2 操作方法

2.1 抗原抗體反應(yīng)

在U型反應(yīng)板上，A1-A10孔每孔加75 uL的1xPBST和25uL被檢血清，以50uL/孔的量稀釋至1∶512；在A11孔加 50uL1xPBST和50uL標準陽性血清，以50uL/孔的量稀釋至1∶1 024；A12孔和B12孔稀釋陰性對照血清，從1∶2稀釋至1∶4；E12-H12孔為病毒抗原對照。

2.2 加病毒抗原

將病毒抗原用1xPBST稀釋至1∶5的工作濃度，以50uL/孔量加入到被檢血清、陰陽性對照的每一個孔中，4孔病毒抗原對照僅加入100uL/孔稀釋好的病毒抗原。每孔加入50uL病毒抗原，封板，振蕩，置4℃冰箱過夜。

2.3 移板

將抗原抗體混合液從U型板上按次序以50uL/孔的量移至已包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上，封板，37℃溫育60min。

2.4 加豚鼠抗體工作液

洗板5次，甩干，以50uL/孔加口蹄疫O型豚鼠抗體工作液，封板，置37℃溫箱溫育30min。

2.5 加兔抗豚鼠IgG-HRP工作液

洗板5次，甩干，以50 uL/孔加兔抗豚鼠IgGHRP工作液，封板，置37℃溫箱溫育30min.

2.6 加底物溶液

洗板5次，直接加底物溶液每孔50uL（加底物溶液之前，按1mL底物溶液加10uL3%雙氧水），37℃溫箱溫育15min。

2.7 加終止液

每孔直接加50 uL終止液，置酶標儀上讀取OD492nm值。

3 結(jié)果判定

3.1 判定試驗是否成立

設(shè)立的4孔病毒抗原對照OD492nm值均在1.0～2.0內(nèi)；陽性對照效價在1∶1024滴度以內(nèi)；陰性對照抗體效價＜1∶8。故而本次試驗成立。

3.2 判定被檢血清抗體效價

病毒抗原4孔，棄去最高和最低OD492nm值，剩余2孔的平均值除以2，即為50%對照值，該值就表示阻斷50%反應(yīng)的對照OD492nm值即臨界值。被檢血清的OD492nm值大于臨界值的孔為陰性孔，小于等于臨界值的孔為陽性孔。若臨界值與稀釋倍數(shù)最高陽性孔的OD492nm值相同，則以被檢血清陽性孔的最高稀釋倍數(shù)作為該份血清的抗體效價；若臨界值處于兩個孔之間，抗體效價取上下兩孔稀釋倍數(shù)的反對數(shù)中間值。

3.3 判定檢測結(jié)果

被檢血清抗體效價大于或等于1∶128判為口蹄疫O型抗體陽性；小于1∶128判為抗體效價陰性[1]。據(jù)統(tǒng)計共檢測牛血清45份，抗體陽性34份，陽性（合格）率75.6%；檢測羊血清45份，抗體陽性42份，陽性（合格）率93.3%。

4 結(jié)果分析

此次引用液相阻斷ELISA試驗檢測牛羊O型口蹄疫免疫抗體各45份，抗體效價均達到農(nóng)業(yè)部規(guī)定的標準（群體抗體效價70%）。抽檢樣品的群體均在2014年10月份注射過口蹄疫雙價苗，截止液相阻斷ELISA試驗操作雖比正向間接血凝試驗(PHA)繁瑣,但它的精確性、穩(wěn)定性遠遠高于正向間接血凝試驗[2]。在操作中幾個關(guān)鍵點把握不好,也會導(dǎo)致實驗結(jié)果發(fā)生偏差或試驗失敗,筆者簡要介紹液相阻斷ELISA操作中的幾點注意事項。

5 小結(jié)

5.1 試劑的回溫及室溫孵育試劑盒中所有試劑,包括包被反應(yīng)板,在使用之前恢復(fù)至室溫(20℃～25℃),特別是冬季氣溫較低,充分的回溫尤為重要。室溫孵育時,控制室溫在 20℃～25℃,避免在冷氣、光照、熱源或通風(fēng)口等溫度不均勻的位置進行檢測,注意不要把反應(yīng)板直接放在冰冷的實驗桌面上,可以墊上東西作為緩沖[3]。

5.2 反應(yīng)時間每次加樣最好按統(tǒng)一順序加,計時要準確。反應(yīng)板多時，要記得依次加樣。

[1]馬軍武,劉湘濤,胡弘博，等.液相阻斷ELISA檢測口蹄疫病毒抗體方法的建立[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會第九次全國口蹄疫學(xué)術(shù)研討會論文集.蘭州：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會口蹄疫分會,2003，364～368.

[2]馬軍武,林密,祁淑蕓.檢測口蹄疫Asia-Ⅰ型病毒抗體液相阻斷ELISA的特異性和敏感性[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會第九次全國口蹄疫學(xué)術(shù)研討會論文集.蘭州：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會口蹄疫分會,2005，378～380.

[3]劉穎，冉多良，王香祖.O型口蹄疫疫苗免疫家畜抗體水平的檢測[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2008（10）.