孔義華 綜述，焦彥朝 審校

(1.貴陽醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科，貴州凱里 556000;2.貴州出入境檢驗檢疫局，貴陽 550004)

?

·綜 述·

單核細胞增生李斯特菌的現(xiàn)代分子生物學分型檢測方法及研究進展*

孔義華1綜述，焦彥朝2審校

(1.貴陽醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科，貴州凱里 556000;2.貴州出入境檢驗檢疫局，貴陽 550004)

單核細胞增生李斯特菌； 脈沖場凝膠電泳； 基因芯片技術； DNA環(huán)介導恒溫核酸擴增法； 基因測序技術

根據(jù)《伯杰氏鑒定細菌學手冊》第9版將李斯特菌屬(listeria)分為2個群7個種，單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes，簡稱LM)為其中1個菌種。LM為革蘭陽性球桿菌，廣泛存在于土壤和飼料中，健康人群、家養(yǎng)及野生動物都被認為是該菌的攜帶者。LM對營養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長，在血平板上能形成狹窄透明的溶血環(huán)。并且LM對低溫有較強的耐受性，因此長期放置在冰箱內的食物容易查出該菌。根據(jù)菌體抗原和鞭毛抗原，LM可分為16個血清型，包括1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。主要以血清型1/2a、1/2b和4b對人致病，約占全球該病病例數(shù)的90%[1]。

LM是一種典型的能夠寄生于巨噬細胞、上皮細胞、內皮細胞和肝細胞胞內的寄生菌，一旦引起人畜共患傳染病的發(fā)生，其病死率高達20%～70%[2]。美國食品藥品管理局(FDA)規(guī)定即食食品中不得檢出LM，而世界衛(wèi)生組織將其列為20世紀90年代4大食源性致病菌之一。1997年3月和8月在我國云南省某縣一自然村內先后兩次暴發(fā)動物源性李斯特菌病，造成村內牲畜大量死亡，動物病死率約為100%，人群發(fā)病率分別為8.2%和8.6%[3]。近年來我國多次在美國、加拿大、法國、愛爾蘭、比利時、丹麥等進口肉類中檢測出李斯特菌。據(jù)加拿大公共衛(wèi)生署(PHAC)報道，加拿大每年約有100～140人感染LM，大約死亡30～50人。據(jù)美國食品藥品管理局(FDA)報道，美國每年約有2 500人感染LM，其病死率高達20%～30%。人群主要通過食用被LM污染的食物而致病，目前LM已被廣泛認為是導致食源性傳染性疾病暴發(fā)流行和散發(fā)病例的重要致病菌。而細菌生物學分型、噬菌體分型和多位點酶電泳等傳統(tǒng)的血清學分型鑒定方法均不能將所有從食品、患者和環(huán)境中分離的LM進行有效的分型檢測，不能滿足現(xiàn)代流行病學分子生物學調查研究的需要。因此，具有高分辨率、自動化、快速、穩(wěn)定和重復性好等特點的現(xiàn)代分子生物學分型方法就更加受到國內外研究者的青睞，而相繼出現(xiàn)的脈沖場凝膠電泳(PFGE)、基因芯片技術、DNA環(huán)介導恒溫核酸擴增法及焦磷酸測序法則具有上述特點。本文現(xiàn)就針對LM的現(xiàn)代分子生物學分型檢測方法及其研究進展進行綜述。

1 PFGE

隨著PFGE方法的不斷改進和完善，該方法已經(jīng)用于沙門菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等常見病原體的分子流行病學調查和分子分型研究。近年來LM的檢測與分型也常采用PFGE。PFGE具有分辨率高、敏感性強、重復性好等特點，能區(qū)分其他方法不能鑒別的菌株(包括LM的4b型)，因此被認為是細菌分型的“金標準”[4]。在PFGE特定的電泳系統(tǒng)中，通過電場方向的不斷交替變換及適宜的脈沖時間等條件，包埋于凝膠中的細菌DNA大片段能夠得到很好的分離，形成清晰的圖譜。不同的脈沖時間其分離的DNA片段大小不同，脈沖時間5～40 s，可以分離(50～600)×103的DNA片段。此外，電壓、脈沖角度、電泳溫度、緩沖液離子濃度等也是不容忽視的條件。在制作凝膠包埋細菌時，細菌濃度對于能否得到高質量、清晰的圖譜也至關重要，需要對其進行嚴格的要求。為了能夠在最短的時間內得到最好的電泳圖譜，許多研究者都致力于建立快速的PFGE分型方法，改進該方法的各個環(huán)節(jié)。Briczinki等[5]研究報道，用快速PFGE法檢測1 d即可得到與其他分型方法完全一致的結果，提示PFGE的改進可以提供一個方便、快速和準確的細菌分子生物學分型方法。這對以后的細菌分子分型和分子流行病學調查起到了積極的推動作用。

Howard等[6]在進行PFGE的過程中采用限制性核酸內切酶ApaⅠ、AscⅠ、NotⅠ和SmaⅠ對LM進行酶切，可以獲得滿意的大片段DNA分子。其中ApaⅠ的分辨力強于SmaⅠ，其酶切后產(chǎn)生的條帶數(shù)目少于SmaⅠ，圖譜清晰易讀[7]。雖然ApaⅠ的分辨力也強于AscⅠ，但由于AscⅠ酶切后只產(chǎn)生8～14個DNA片段，較ApaⅠ酶切后產(chǎn)生的DNA片段數(shù)(18～23個)少，因此AscⅠ酶切后所得數(shù)據(jù)更易解釋。病原菌分子分型實驗室監(jiān)測網(wǎng)絡(PulseNet)推薦，在使用PFGE鑒別LM的過程中聯(lián)合應用限制性內切酶可提高PFGE的分辨力。例如當分析流行病學相關的菌株是否為同一型別時，可聯(lián)合使用ApaⅠ和AscⅠ酶將其區(qū)分(包括4b型)，且結果也易于觀察和解釋。PFGE已成為LM分型的最優(yōu)方法之一[8]。目前國內外主要是采用限制性內切酶ApaⅠ或(和)AscⅠ對LM進行PFGE分型。在美國1998年與2002年先后發(fā)生的2次由LM引起的暴發(fā)流行事件中，PulseNet實驗室正是采用PFGE分型方法成功地追蹤到傳染源[9]。

然而，該方法也存在一定的局限性。在細菌基因變異的情況下，由于PFGE只能提供有限的遺傳信息，不能鑒別特點基因的存在和缺失。并且由于點突變、缺失或插入等單一基因事件的發(fā)生，PFGE在長期的流行病學研究中顯得并不穩(wěn)定。此外，限制性內切酶只能對大多數(shù)血清型的LM菌株進行酶切，雖然聯(lián)合應用限制性內切酶可以提高檢測的穩(wěn)定性，但卻導致實驗時間的延長。這些問題都有待進一步的探討和解決。

2 基因芯片技術

基因芯片技術是20世紀90年代初發(fā)展起來的一種全新微量分析技術，有著自動化、高通量、集成化等突出特點，其在微生物重要基因(如抗藥基因、毒力基因、致病因子)的篩選監(jiān)測和基于細菌基因組的流行病學研究中得到了廣泛的研究，尤其是近年來基因芯片和液相芯片的研究。其原理：提取的生物標本DNA經(jīng)PCR擴增后制備熒光標記探針，然后與提前點樣于芯片表面的寡核苷酸雜交，最后通過檢測雜交信號的強度和分布來確定檢測樣品中特定微生物的存在和豐度。Chizhikov等[10]采用寡核苷酸芯片研究了大腸桿菌、志賀菌、LM及沙門菌株的抗原決定簇和毒力因子與其致病性的關系，發(fā)現(xiàn)細菌毒力基因經(jīng)多重PCR擴增后，結合基因芯片雜交篩選方法完全可以用于某些腸道致病菌的分析檢測。Wilson等[11]研發(fā)出一套可同時檢測18種致病菌(包括原核生物和真核生物)的多病原體識別微陣列，對炭疽桿菌的檢測極限可達10 fg。LM、大腸桿菌0157和沙門菌等致病菌是危害食品安全的主要致病菌，研發(fā)出快速、準確、自動化的檢測方法已成為確保食品安全的重要任務。

Volokhov等[12]以LM的6個毒力因子基因(hly、inlB、plcA、plcB、clp、iap)為靶基因建立了檢測和鑒別LM的基因芯片技術，可簡便、迅速地檢測LM的6個基因型。Borucki等[13]采用585個探針建立了一個混合基因組芯片，通過對24株LM進行分析表明，該芯片對主要致病血清型可以作出良好的分析，所得聚類結果和系統(tǒng)進化分支結果一致；此外，還可鑒別同一血清型的不同菌株，并發(fā)現(xiàn)了一些可用于流行病學研究的遺傳標記。胡瑞等[14]利用多指標同步分析(xMAP)液態(tài)芯片技術在4 h內成功地檢測出了包括LM在內的4種引起食源性疾病的重要病原菌，其靈敏度可高達200 cfu/mL。盡管基因芯片技術在實際應用中還存在檢測費用較高、實驗室應用過程中的標準化及前期研發(fā)投入高昂等問題，但它已在病原菌的基因分型和菌種鑒定方面展示了非常廣闊的應用前景[15]。

3 DNA環(huán)介導恒溫核酸擴增法

DNA環(huán)介導恒溫核酸擴增法(LAMP)是一種連續(xù)、恒溫、基于酶反應的，可用于細菌和病毒的定性檢測的新型核酸擴增方法，具有高特異性和等溫快速擴增的特點。其原理：針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在65 ℃左右恒溫保存幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應，且1 h內可擴增靶基因至1010倍。反應過程不會受到反應混合物的影響且受非靶序列DNA分子的影響較小。同時，在等溫條件下擴增，不會因溫度的改變而造成時間損失，并且模板也不需要進行熱變性，從而保證了LAMP擴增的高效特異性。LAMP具有操作快捷、簡便、實驗裝置簡單、費用低廉和可以通過肉眼判斷目的基因擴增與否等優(yōu)點。在李斯特菌屬中保守且特有的是編碼李斯特菌溶血素(LLO)的hly基因。馬保華等[16]使用商業(yè)化的LAMP試劑盒在進口凍肉中檢出7份LM陽性的樣品，并與常規(guī)檢驗方法進行對比實驗，表明采用LAMP技術檢測LM的準確率可達100%。易海華等[17]采用LAMP與PCR方法同時檢測LM的hly基因并進行對比，結果顯示LAMP比PCR的靈敏度高100倍以上。但是該方法所需要設計的引物數(shù)量相對較多、結構復雜，尤其在病原體出現(xiàn)高度變異的時候難以進行。同時，在設計引物時還必須考慮靶序列的片段和莖環(huán)結構等因素。此外，該方法每次反應只能檢測一個病原菌，其陽性反應也并不單是呈現(xiàn)單條帶，容易出現(xiàn)拖尾和一些低分子質量的條帶，且一旦產(chǎn)生非特異性擴增就不易鑒別。

4 焦磷酸測序技術

在細菌鑒定分型的分子生物學方法中，能夠提供核酸堿基序列資料的分子診斷技術成為細菌鑒定分型的金標準。在利用Sanger法的DNA測序技術中，所測DNA長度可達1 000 bp。但是在實際工作中，如果引物選擇恰當，只需要通過分析已知DNA序列片段中的幾十對堿基即可滿足細菌分型檢測的需要[18]，而近幾年發(fā)展起來的焦磷酸測序技術就能達到該要求。

焦磷酸測序技術是一種準確、快速、實時進行短片段DNA序列分析的方法，是一種依靠生物發(fā)光進行DNA序列分析的技術。在DNA聚合酶、熒光素酶、腺三磷酸雙磷酸酶和硫酸化酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP(dATPαS、dTTP、dCTP、dGTP)聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度達到測定DNA序列的目的。新發(fā)展的焦磷酸測序技術無須對DNA片段進行熒光標記，也無須進行電泳，因此相應的儀器系統(tǒng)就不需要熒光分子的激發(fā)和檢測裝置[19]。李秀娟等[20]在用焦磷酸測序技術對LM的hly基因保守序列進行測序時發(fā)現(xiàn)第7個堿基的A與G置換，從而可以建立用焦磷酸測序技術對LM進行分子分型的方法。盡管用該方法進行分型有可能分型的種類較少，但是通過測序、分型一項實驗就能完成，并且其結果可靠、穩(wěn)定、操作簡單，極大地減少了常規(guī)檢測和分型的工作量。

5 展 望

由于LM分布廣，適應能力強，對人類威脅較大，能使人致病的最小致病濃度尚不清楚，因此研發(fā)簡單快速、靈敏高效、成本低、自動化程度高的檢測技術顯得非常重要。但是，目前還沒有一種方法可以同時兼?zhèn)湟陨蟽?yōu)點。病原微生物的高通量檢測技術是近年發(fā)展起來的前沿技術，在病原微生物的檢測分型和預防控制領域具有十分重要的應用價值。由于其所需樣品和劑量較少、快速省時、診斷結果精確、自動化操作程度較高，適宜用于食源性病原微生物的診斷與分型。PFGE、LAMP、基因芯片技術和焦磷酸測序技術等檢測方法各有其優(yōu)缺點，對這些技術在病毒、細菌的分型檢測及傳染病監(jiān)控等方面的應用已經(jīng)進行了大量研究。相信隨著研究的不斷進展和深入，這些高通量診斷分型技術和方法會不斷完善，在食源性傳染病病原體檢測分型方面起到更加重要的作用。

[1]唐家琪．自然疫源性疾病[M]．北京：科學出版社，2005：899-912．

[2]沈瑩．單核細胞增生性李斯特菌在食品安全中的研究近況[J]．中國熱帶醫(yī)學，2008，8(3)：484-487．

[3]肖義澤，任麗娟，王金玉，等．云南省首次動物源性李斯特菌病暴發(fā)的流行病學調查[J]．中華流行病學雜志，2000，21(3)：236．[4]Fakhr MK，Nolan LK，Lague CM．Multilocus sequence typing lacks the discriminatory ability of pulsed-field gel electrophoresis for typing Salmonella enterica serovar Typhimurium[J]．J Clin Microbiol，2012，43：2215-2219．

[5]Briczinki EP，Roberts RF．Technical note:a rapid pulsed-field gel electrophoresis method for analysis of bifidobacteria[J]．J Dairy Sci，2006，89(7)：2424-2427．

[6]Howard PJ，Harsono KD，Luchansky JB．Differentiation of Listeria monocytogenes,Listeria innocua,Listeria ivanovii and Listeria seeligeri by pulsed-field gel electrophoresis[J]．Appl Environ Microbiol，1992，58(2)：709-712．

[7]Vela AI，F(xiàn)ernandez-garayzabal JF，Vazquez JA，et al．Molecular typing by pulsed-field gel eletrophoresis of Spanish animal and human Listeria monocytogenes isolates[J]．Appl Environ Microbiol，2011，67(12)：5840-5843．

[8]Boerlin P，Bannerman E，Jemmi T，et al． Subtyping Listeria monocytogenes isolates genetically related to the Swiss epidemic clone[J]．J Clin Microbiol，1996，34(9)：2148-2153．

[9]Graves LM，Hunter SB，Ong AR，et al．Microbiological aspects of the investigation that traced the 1998 outbreak of listeriosis in the United States to contaminated hot dogs and establishment of molecular subtyping-based surveillance for Listeria monocytogenes in the PulseNet Network[J]．J Clin Microbiol，2005，43(5)：2350-2355．

[10]Chizhikov V，Rasooly A，Chumakov K，et al．Microarray analysis of microbial virulence factors[J]．Appl Environ Microbiol，2001，67(7)：3258-3263．

[11]Wilson WJ，Strout CL，DeSantis TZ，et al．Sequence-specific identification of 18 pathogenic microorganisms using microarray technology[J]．Mol Cell Probes，2002，16 (2)：119-127．

[12]Volokhov D，Rasooly A，Chumakov K，et al．Identification of Listeria species by microarray-based assay[J]．J Clin Microbiol，2002，40(12)：4720-4728．

[13]Borucki MK，Krug MJ，Muraoka WT，et al．Discrimination among listeria monocytogenes isolates using a mixed genome DNA microarray[J]．Vet Microbiology，2003，92(4)：351-362．

[14]胡瑞，趙金銀，陳德坤，等．應用XMAP液態(tài)芯片多重快速檢測四種病原微生物的研究[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2008，8(12)：2232-2235．

[15]詹鑾峰，郭維值．病原菌鑒定分型方法的研究概況[J]．海峽預防醫(yī)學雜志，2006，12(2)：26-28．

[16]馬保華，李賀，高家明，等．使用LAMP技術快速檢測單增李斯特氏菌[J]．中國動物檢疫，2008，25(12)：42-44．

[17]易海華，祝長青，宋陽威，等．食品中單增李斯特菌環(huán)介導等溫擴增檢測技術[J]．食品科學，2011，32(4)：203-207．

[18]Gharizadeh B，Kalantari M，Garcia CA，et al．Typing of human papillomavirus by pyrosequencing[J]．Lab Invest，2001，81(5)：673-679．

[19]倪紅兵，鞠少卿，王惠民．焦磷酸測序技術及其應用進展[J]．國外醫(yī)學：臨床生物化學與檢驗分冊，2005，26(9)：600-605．

[20]李秀娟，徐保紅，田會芳，等．焦磷酸測序法檢測單增李斯特菌[J]．中國衛(wèi)生檢驗志，2010，20(7)：1623-1625．

國家質檢總局科技計劃項目(2011IK165)；貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費項目(TZJF-2011-18)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.06.053

A

1672-9455(2015)06-0843-03

2014-07-26

2014-10-17)