張洋婷，郗艷麗，白春燕,馬洪波，李善姬*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，吉林 吉林　132013;2.沈陽市93256部隊衛(wèi)生隊,遼寧 沈陽　110043)

·綜述·

人參皂苷體外轉(zhuǎn)化和分析方法的研究進(jìn)展Progress on transformation and analysis method of ginseng saponins

張洋婷1，郗艷麗1，白春燕2,馬洪波1，李善姬1*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，吉林 吉林132013;2.沈陽市93256部隊衛(wèi)生隊,遼寧 沈陽110043)

摘要：人參皂苷因其獨特的生物活性和藥用價值而受到人們越來越多的關(guān)注。人參皂苷種類繁多，且不同品種的人參中其含量差異較大，故而傳統(tǒng)的加工工藝無法有效的將其分離提取出來。因此，人參的深加工技術(shù)成為熱點話題。本文對人參皂苷的體外轉(zhuǎn)化及分析等方法進(jìn)行簡要概述。

關(guān)鍵詞：人參;人參皂苷;生物轉(zhuǎn)化

文章編號：1673-2995(2015)02-0121-04

中圖分類號：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：識碼： A

作者簡介：張洋婷(1987-)，女(漢族)，助教，碩士.

通訊作者：李善姬(1969-)，女(朝鮮族)，副教授，博士.

收稿日期：( 2014-11-06)

人參是五加科、人參屬植物，其作為藥材使用己有兩千多年的歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等古代醫(yī)藥書籍都詳細(xì)的記述了人參的醫(yī)用價值[1]，一直被視為中藥中的翹楚。

研究發(fā)現(xiàn)人參中含有多種化學(xué)成分，如人參皂苷、多糖、酚性化合物、多肽及氨基酸、生物堿、維生素、揮發(fā)性油、微量元素、甾醇類及酶類等[2]成分。其中人參皂苷是人參的主要有效成分之一，它是由皂苷元與糖結(jié)合而形成的糖苷類化合物，含量約為4%。人參皂苷一般呈白色、無定形粉末，或無色、針狀結(jié)晶，味微甘苦。人參皂苷按照苷元的結(jié)構(gòu)不同可分為達(dá)瑪烷型(Dammarene type)、齊墩果酸型(Oleanolic acid type)和奧克梯隆型(Ocotillol type)。達(dá)瑪烷型人參皂苷又根據(jù)苷元上所連有羥基不同分為原人參二醇型(Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd 等)和原人參三醇型(Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1)；而齊墩果酸型皂苷則是五環(huán)三萜型皂苷，人參皂苷 R0是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的該類皂苷。

一般人參所含有的皂苷中，齊墩果酸類皂苷占7%～10%，原人參二醇類皂苷45~60%，原人參三醇類皂苷占12～20%。迄今為止，科學(xué)家們已分離出來200多種人參皂苷和非皂苷成分并確定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)[3]。此外，對人參皂苷藥理作用的研究也較為廣泛，研究表明人參皂苷具有抗腫瘤[4]、抗衰老[5]、抗血栓和動脈硬化[6-8]、增強機體免疫功能、降血糖[9]等作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)某些人參皂苷對心肌缺血[10-11]、燒傷創(chuàng)面愈合[12]、人的精子活力[13]等具有特殊療效。

近代研究發(fā)現(xiàn)，人參中所含有的低極性、稀有人參皂苷具有更強的生物活性，更易被機體吸收，大量制備次級苷和苷元具有明顯的藥用價值和商業(yè)價值。但其在人參中含量極少，單純的依靠提取分離技術(shù)很難滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。因此，利用體外轉(zhuǎn)化方法制備人參皂苷具有深遠(yuǎn)意義。

1常見的人參皂苷體外轉(zhuǎn)化方法

人參皂苷的體外轉(zhuǎn)化方法主要有物理方法、化學(xué)方法、酶水解法以及微生物轉(zhuǎn)化法，其中微生物轉(zhuǎn)化法又包括液體發(fā)酵法和固體發(fā)酵法。

1.1　物理方法

加熱法，指通過高溫和高壓的方式將人參皂苷的糖側(cè)鏈強行斷裂，使之形成C-20位去糖基的次級皂苷的方法。傳統(tǒng)的紅參加工就采用的這種方法，該法操作簡單，但對反應(yīng)條件要求高，這是因為在蒸制過程中會造成人參二醇型皂苷和人參三醇型皂苷的大量流失，而且易形成副產(chǎn)物，給后續(xù)的提純帶來困難，故此法不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

1.2　化學(xué)方法

1.2.1酸水解法

酸水解法主要是利用人參皂苷在酸性條件下可水解生成次級皂苷和皂苷衍生物而實現(xiàn)的。劉志輝[13]利用醋酸水解法從三七總皂苷中獲得了人參皂苷Rg3。Bae Ea[14]通過酸水解法將二醇型皂苷水解為皂苷Rg3、20(S)-Rg3和20(R)-Rg3。陶娌娜[15]采用酸降解法從人參根總皂苷中分離出人參皂苷20(R)-Rg3和 20(R)-Rh2。但此反應(yīng)劇烈，皂苷元母環(huán)易發(fā)生脫水、環(huán)合、雙鍵位移及互變異構(gòu)等不同反應(yīng)，得不到原苷元，降低了有價值的次級皂苷轉(zhuǎn)化率。

1.2.2堿裂解法

堿裂解法是指在高溫、高壓及堿性條件下分解人參皂苷，并獲得單一構(gòu)型的次級皂苷，產(chǎn)物易于純化分離，但對反應(yīng)溫度、壓力、pH等條件要求苛刻。姜永濤等[16]采用堿降解法從西洋參莖葉總皂苷中分離出5種人參皂苷：Rh1、Rh2、Rk2、Rg3和達(dá)瑪烷型-20(21)，24-二烯-3β，12β-二醇。吳彥君[17]在堿性條件下降解人參皂苷 Re,并分離鑒定得到 20(S)-PPT、人參皂苷-Rk3、20(S)-人參皂苷-Rh1、人參皂苷-Rg6、20(S)-人參皂苷-Rg2和 20(S)-人參皂苷-Rg1六種化合物。叢登立等[18]用堿溶液降解西洋參總皂苷得到人參皂苷20(S)-Rh2和20(S)-Rg3。

1.3　酶水解法

酶水解法是通過提取生物體內(nèi)或者分泌的生物酶(β-葡萄糖苷酶、高峰淀粉酶、陳皮苷酶、纖維素酶、橙皮苷酶、柚皮苷酶及果膠酶等)水解人參皂苷糖基側(cè)鏈，生產(chǎn)稀有皂苷的方法。酶解法具有一定的特異性，但其對酶的質(zhì)量和純度要求較高；其次，水解酶不穩(wěn)定，極易發(fā)生異構(gòu)甚至失活；再次，有些水解酶的最適反應(yīng)溫度較高，耗能較大，增加了工業(yè)生產(chǎn)成本。KIM[19]采用果膠酶酶解法對人參皂苷提取液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得人參皂苷Compound K(CK)。韓穎[20]利用甘蔗鐮孢霉與工業(yè)用酶將三七莖葉皂苷Rb1、Rb2轉(zhuǎn)化成Rd，將Rc轉(zhuǎn)化成稀有皂苷CK。WANG Dongming等[21]研究發(fā)現(xiàn)了一種Ⅳ型人參皂苷糖苷酶，可與原人參三醇類皂苷6-O-上的多種糖基發(fā)生水解反應(yīng)。

1.4　微生物轉(zhuǎn)化方法

微生物發(fā)酵法，主要是利用微生物代謝產(chǎn)生的特定酶，對人參皂苷進(jìn)行定向水解，進(jìn)而獲得次級皂苷的過程。與物理或化學(xué)方法相比，此法反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)選擇性強、副產(chǎn)物少、后處理簡單等特點。因此，該方法已成為人參皂苷生物轉(zhuǎn)化的首選方法。

1.4.1液體發(fā)酵

液體發(fā)酵是指在液體條件下，利用微生物產(chǎn)生的水解酶對人參皂苷進(jìn)行發(fā)酵的方法。由于高濃度人參皂苷對菌株有抑制作用，影響菌體正常生長代謝，降低產(chǎn)酶量。這種抑制在液體環(huán)境中表現(xiàn)尤為明顯。因此工業(yè)生產(chǎn)中人參皂苷的投料量不高，無法擴(kuò)大生產(chǎn)。為獲得足夠的次級皂苷產(chǎn)物，需要多批次發(fā)酵生產(chǎn)，帶來了反復(fù)活化菌種，滅菌培養(yǎng)基的步驟，對資源產(chǎn)生了浪費，增加成本。Cheng等[22]利用微生物菌株M.esteraromaticum GS514可將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為Rd，最終轉(zhuǎn)化成Rg3。白龍律等[23]發(fā)現(xiàn)了青霉的一種擴(kuò)展菌類——綠毛狀GY206菌，可將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為Rg3。王青等[24]發(fā)現(xiàn)了9株能將三七提取物轉(zhuǎn)化為高活性人參皂苷的微生物菌株，其中菌株TR-20還能將三七提取物微轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg3。

1.4.2固體發(fā)酵

固體發(fā)酵是一個雙向發(fā)酵的過程，一方面是人參等藥材作為基質(zhì)，為菌體提供營養(yǎng)物質(zhì)；另一方面菌體代謝產(chǎn)生的酶對人參皂苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，將其轉(zhuǎn)化為活性更高的稀有人參皂苷。這種方法工藝簡單，質(zhì)量易于控制，次級人參皂苷含量豐富，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。由于微生物與發(fā)酵產(chǎn)物不需要分離，在生產(chǎn)過程中沒有擺脫對菌株自產(chǎn)酶系的依賴，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化產(chǎn)物比較單一。因此該方法對菌種和底物的選擇較為嚴(yán)格，同時對反應(yīng)的時間、溫度和PH等也要嚴(yán)格控制。

劉逆夫[25]利用紫紅色紅曲霉對三七等中藥材進(jìn)行固體發(fā)酵，當(dāng)實驗滿足發(fā)酵時間7 d，起始含水量50%，反應(yīng)溫度33 ℃，相對濕度90%，攪拌速度15 r/min等條件時，人參皂苷Rg1的含量顯著增加。畢華等[26]用大型擔(dān)子菌L10對人參進(jìn)行固體發(fā)酵，結(jié)果顯示經(jīng)發(fā)酵后皂苷Rg1、Re、Rb1的含量降低近98%，同時生成稀有皂苷Rg3、Rh1，二者的含量分別為0.09%和0.009%。

2人參皂苷的分析方法

2.1　比色法

比色法(Colorimetry)是分析皂苷類成分的常用方法。其原理是在一定酸性條件、一定溫度下顯色試劑可與皂苷類成分生成顯色物質(zhì)，并在一定波長處可測量其吸光度值。常用的顯色試劑有香草醛-冰醋酸、香草醛-濃硫酸、香草醛-高氯酸、濃硫酸等。這種方法無法對單一皂苷進(jìn)行定量測定，只能用于測定總皂苷的含量。這種方法的缺點是重現(xiàn)性差，因此顯色變化的程度受溫度的影響較大。

2.2　薄層色譜法

薄層色譜法(TLC)又稱薄層層析，屬于固-液吸附色譜法。利用不同物質(zhì)的保留時間不同，使用展開劑來分層帶走硅膠G薄層板不同物質(zhì)，硫酸乙醇溶液作為顯色劑。此法操作簡單、分離制備效果較好，結(jié)果準(zhǔn)確，兼具柱色譜和紙色譜的優(yōu)點，且專屬性針對某類皂苷，因此常用于人參皂苷的定性鑒別。但易受反應(yīng)條件的限制，其精密度和準(zhǔn)確度遠(yuǎn)不如高效液相色譜等方法。

2.3　高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)又稱高效液相層析，采用高壓輸液系統(tǒng)，以液體為流動相，當(dāng)人參皂苷通過液相分離柱時，不同種類的皂苷分子的保留時間不同，再利用紫外檢測器或者蒸發(fā)光散射檢測器等進(jìn)行檢測，從而實現(xiàn)對人參皂苷的定性和定量分析[27]。常用的流動相包括水-甲醇、水-乙腈，也可加入適量的磷酸以調(diào)節(jié)峰型，常用的固定相有Rp-18、ODS、腈基鍵合柱和氨基鍵合柱等。張偉等[28]利用高效液相色譜法從原料中分離、純化人參皂苷Re和Rg1，其中Re的純度高達(dá)91%，收率為92%。高效液相色譜法是一種精確度高、靈敏度高、自動化程度高、回收率高、重現(xiàn)性好的分析方法，但是此類方法的設(shè)備投資較高，不宜普及。

2.4　高效液相色譜-紫外吸收聯(lián)用法

高效液相色譜-紫外吸收聯(lián)用法(HPLC-UV)，因為紫外檢測器的吸收波長是203 nm，容易受到流動相等試劑的干擾，影響定量結(jié)果。目前，應(yīng)用HPLC-UV法測定人參皂苷含量的文獻(xiàn)報道較多。

2.5　高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)是用高效液相色譜對人參皂苷進(jìn)行精確分離，將質(zhì)譜儀作為檢測器。它兼顧了HPLC 的高分離效能和質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性的特點，在測定單體皂苷含量的同時，還能達(dá)到定性、定量的檢測目的，還可以對皂苷分子的分子信息進(jìn)行分析。采用HPLC-MS法進(jìn)行人參皂苷測定的文獻(xiàn)報道較多[29]。

3展望

研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷、次級皂苷和皂苷元等成分具有較高的藥用價值，但其在人參屬植物中含量較少，必須通過降解總皂苷而獲取。因此人參的深加工技術(shù)、有效成分的提取、轉(zhuǎn)化及分析等工藝越來越受到人們的關(guān)注。人參體外轉(zhuǎn)化工藝技術(shù)的完善與成熟，必將推進(jìn)人參皂苷產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的步伐，從而帶動人參藥理學(xué)、藥物化學(xué)以及人參深加工技術(shù)的全面發(fā)展，給地區(qū)帶來一定的經(jīng)濟(jì)和社會效益。

參考文獻(xiàn)：

[1]王鐵生.中國人參[M].沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2001.

[2]張語遲.人參綠色生產(chǎn)加工及質(zhì)量控制技術(shù)研究[D].長春：長春中醫(yī)藥大學(xué)，2008.

[3]Wang JH.Chemical study on ginseng[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006,3-17.

[4]Xie Xiaowei,Eberding A,Madera C,et al.Rh2 synergistically enhances paclitaxel or mitoxantrone in prostate cancer models[J].J Urol,2006,175(5):1926-1931.

[5]睢大簣,于曉風(fēng),曲紹春,等.20S-原人參二醇皂苷對高脂血癥大鼠血脂代謝的影響及其抗氧化作用[J].中草藥,2004,35(4):416-419.

[6]趙燕威，于曉鳳，徐華麗，等.人參果皂苷注射液對高脂血癥大鼠血脂代謝的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2005,31(3):407-410.

[7]王亞紅，秦建國，郭維琴，等.人參皂苷抗高血脂癥及動脈粥樣硬化的實驗研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2006,24(3):429-439.

[8]Lai DM,Tu YK,Liu IM,et al.Mediation of β-endorphin by ginsenoside Rh2 to lower plasma glucose in streptozotocin induced diabetic rats[J].Planta Med,2006,72(1):9-13.

[9]劉玉蓮.人參皂苷Rb組單體和Rd對心肌缺血干預(yù)作用及機制的研究[D].長春：吉林大學(xué)，2009.

[10]馬博.中藥治療心律失常的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2008,5(5):22-23.

[11]Kimura Y,Sumiyoshi M,Kawahira K,et al.Effects of ginseng saponins isolated from Red Ginseng roots on burn wound healing inmice[J].Br J Pharmacol,2006,148(6):860-870.

[12]Zhang Hong,Zhou Qingmin,Li Xiaoda,et al.Ginsenoside R(e) increases fertile and asthenozoospermic infertile human sperm motility by induction of nitric oxide synthase[J].Arch Pharm Res,2006,29(2):145-196.

[13]劉志輝，李琳，錢芳.醋酸水解三七總皂苷制備人參皂苷Rg3工藝的優(yōu)選[J].中國醫(yī)藥學(xué)雜志，2009,29(11):881-884.

[14]Bae EA,Han MJ,Kim EJ,et al.Transformation of ginseng saponins to ginsenoside Rh2 by acids and human intestinal bacteria and biological activities of transformants[J].Arch Pharm Res,2004,27(1):61-67.

[15]陶娌娜.人參根總皂苷酸降解產(chǎn)物的化學(xué)成分研究[D].長春：吉林大學(xué)藥學(xué)院，2009.

[16]姜永濤，陳繼永，馬雙剛，等.西洋參總皂苷堿降解產(chǎn)物的分離及結(jié)構(gòu)鑒定[J].煙臺大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)與工程版，2006,19(2):142-147.

[17]吳彥君.人參皂苷-Re堿降解產(chǎn)物的成分研究[D].長春：吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，2008.

[18]叢登立，鞠會艷，張崇禧.20(S)-人參皂苷-Rh2和20(S)-人參皂苷-Rg3的制備與鑒定[C].科技創(chuàng)新與節(jié)能減排——吉林省第五屆科學(xué)技術(shù)學(xué)術(shù)年會論文集(下冊)，2008:771-773.

[19]Kim BH,Lee SY,Cho HJ,et al.Biotransformation of Korean Panax ginseng by pectinex[J].Biol Pharm Bull,2006,29(12):2472-2478.

[20]韓穎，胡筱敏，姜彬慧.甘蔗鐮孢霉與工業(yè)用酶制劑對三七莖葉有效成分轉(zhuǎn)化作用的比較[J].生態(tài)學(xué)雜志，2008,27(8):1434-1437.

[21]Wang Dongming,Yu Hongshan,Song Jiangguo,et al.A novel ginsenosidase from an Aspergillus strain hydrolyzing 6-O-multi-glycosides of protopanaxatriol-type ginsenosides,named ginsenosidase type Ⅳ[J].J Microbiol Biotechnol,2011,21(10):1057-1063.

[22]Cheng LQ，Na JR，Bang MH，et al.Conversion of major ginsenoside Rb1 to 20(S)-ginsenoside Rg3 byMicrobacteriumsp.GS514[J].Phytochemistry,2008,69(1):218-224.

[23]白龍律，臧蘊霞，尹成日.微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1為Rg3的研究[J].延邊大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009,35(2):141-144.

[24]王青，袁萍，茅仁岡，等.轉(zhuǎn)化三七提取物為人參皂苷Rg3的真菌分離鑒定[J].華東師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011(6):115-121.

[25]劉逆夫，婁勇軍，王伶俐，等.中藥克癀膠囊藥用原料的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究[J].中南藥學(xué),2007,5(4):314-316.

[26]畢華.大型擔(dān)子菌L10固體發(fā)酵人參實驗研究[D].長春：長春中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[27]王永祿，王麗瑤.制備型高效液相色譜法及其在中藥研究中的應(yīng)用[J].中醫(yī)藥通報，2006,5(3):60-63.

[28]張偉，林炳昌，李芊.高效液相色譜法-重結(jié)晶法分離人參皂苷單體Re[J].特產(chǎn)研究，2008(1):60-63.

[29]肖盛元，羅國安.紅參加工過程中人參皂苷化學(xué)反應(yīng)HPLC/MS/MS研究[J].中草藥，2005,36(1):40-43.