黃維真 綜述,潘新年 審校

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院/婦產(chǎn)醫(yī)院/兒童醫(yī)院，南寧 530021)

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·綜 述·

腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的研究進(jìn)展

黃維真 綜述,潘新年 審校

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院/婦產(chǎn)醫(yī)院/兒童醫(yī)院，南寧 530021)

碳青霉烯酶； 腸桿菌科細(xì)菌； 檢測(cè)方法

碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物是抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、殺菌作用快的β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物，其良好的細(xì)胞通透性、高度的酶穩(wěn)定性及較低的毒性等特點(diǎn)已成為目前臨床治療嚴(yán)重細(xì)菌感染最主要的抗菌藥物之一，但是隨著碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的腸桿菌科細(xì)菌的出現(xiàn)及不斷的增多，該類(lèi)藥物的臨床應(yīng)用受到了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌，對(duì)于預(yù)防和控制產(chǎn)酶菌株的傳播具有重要意義?，F(xiàn)就實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的研究進(jìn)展作一綜述。

1 產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的篩查(表型篩查試驗(yàn))

準(zhǔn)確檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的耐藥性是篩選產(chǎn)酶菌株的關(guān)鍵，試驗(yàn)方法及底物選擇影響產(chǎn)酶菌株的篩選。Anderson等[1]以blaKPC基因作為金標(biāo)準(zhǔn)，采用亞胺培南、美羅培南、厄他培南對(duì)微量肉湯稀釋法、E-test法、平板稀釋法、Microscan Autoscan、Vitek-2等方法作比較，微量肉湯稀釋法對(duì)3種抗菌藥物敏感性大于90%，能較好檢測(cè)出細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的耐藥性。不同實(shí)驗(yàn)底物對(duì)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌篩查的敏感性、特異性各不相同，Landman等[2]研究報(bào)道，以厄他培南作底物的肉湯稀釋法、E-test法、平板稀釋法、自動(dòng)化儀器法敏感性大于90%,為最高，但特異性低于亞胺培南和美羅培南，提示厄他培南應(yīng)該作為藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)最佳底物。近期有研究顯示，菌株對(duì)厄他培南的敏感性下降是產(chǎn) KPC酶的敏感標(biāo)志[3]。2010 年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)對(duì)腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯類(lèi)藥物折點(diǎn)進(jìn)行了修訂，耐藥范圍能更好地覆蓋最小抑菌濃度(MIC) 值較低的產(chǎn)酶菌株。然而，篩查范圍過(guò)寬會(huì)造成高產(chǎn)AmpC 或產(chǎn) CTX-M 型 ESBLs 合并外膜通道蛋白缺失菌株非特異的假陽(yáng)性[4]。由于碳青霉烯酶耐藥異質(zhì)性，至今尚未有對(duì)所有產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌表型檢測(cè)的公認(rèn)和CLSI等國(guó)際權(quán)威機(jī)構(gòu)推薦的方法。因此，對(duì)碳青霉烯酶的篩查需要敏感性更高的檢測(cè)方法。

2 表型確認(rèn)試驗(yàn)

2.1 改良Hodge(MTH) MTH是CLSI推薦的用于檢測(cè)碳青霉烯酶表型的確認(rèn)試驗(yàn)。CLSI根據(jù)美國(guó)大量腸桿菌科分離菌株進(jìn)行試驗(yàn)，MTH檢測(cè)這些分離菌株中的KPC，敏感度和特異度均大于90%。MTH在篩選產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌時(shí)敏感性低、特異性差、周期長(zhǎng)，對(duì)低水平金屬β-內(nèi)酰胺酶的敏感性和特異性有待評(píng)估。MTH不能區(qū)分碳青霉烯酶類(lèi)型，其他耐藥機(jī)制(如CTX-M、AmpC)存在時(shí)也可能出現(xiàn)25%的假陽(yáng)性。Fernando 等[5]設(shè)計(jì)在MHT加入苯硼酸和苯唑西林進(jìn)行改良MTH，改良后MHT對(duì)A類(lèi)碳青霉烯酶檢測(cè)的靈敏度和特異性更高(>90%,100%),通過(guò)不同圖形可將產(chǎn)KPC、GES、SME、IMI、NMC A類(lèi)碳青霉烯酶與ESBLs、AmpC、MBLs、非A類(lèi)碳青霉烯酶區(qū)分開(kāi)來(lái)。

2.2 紙片增效試驗(yàn) 碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物加上酶抑制劑紙片增效試驗(yàn)常作為檢測(cè)金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)的方法，根據(jù)乙二胺四乙酸(EDTA)抑制MBL特性的E-test試條作為檢測(cè)MBL建議的方法，但是由于E-test試紙條成本較高，其他β-內(nèi)酰胺酶耐藥機(jī)制和膜孔蛋白缺失或高度表達(dá)影響MIC的結(jié)果[6]。一種包含美羅培南聯(lián)合抑制劑EDTA、吡啶二羧酸、氨基苯硼酸、氯唑西林碳青霉烯酶檢測(cè)的試驗(yàn)，可檢測(cè)出KPC、VIM、IPM、OXA和碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌伴膜孔蛋白缺失ESBL、AmpC[7]。利用苯硼酸對(duì)KPC的高敏感度，合并AmpC和膜孔蛋白缺失也可檢出，與KPC不同，氯唑西林對(duì)AmpC和膜孔蛋白有協(xié)調(diào)作用。EDTA、吡啶二羧酸擁有較高的靈敏度檢測(cè)產(chǎn)金屬酶肺炎克雷伯菌，EDTA特異性較差，少量ESBL、KPC、OX-48也可出現(xiàn)陽(yáng)性，但吡啶二羧酸特異性較強(qiáng)，只有MBL出現(xiàn)陽(yáng)性，ESBL、KPC、OX-48都為陰性。Emilie 等[8]報(bào)道拉氧頭孢+EDTA協(xié)同試驗(yàn)檢測(cè)MBL，拉氧頭孢高水平水解質(zhì)粒介導(dǎo)的金屬β-內(nèi)酰胺酶，但對(duì)絲氨酸碳青霉烯酶水解能力偏弱，拉氧頭孢對(duì)所有MBL(包括IPM、VIM等)都耐藥(<23 mm),EDTA能增強(qiáng)拉氧頭孢抑菌圈直徑(≥10 mm)。拉氧頭孢敏感試驗(yàn)作為常規(guī)抗菌試驗(yàn)，用于敏感篩選MBL甚至低產(chǎn)MBL的方法。拉氧頭孢+EDTA協(xié)同試驗(yàn)用于不同MBL及膜孔蛋白改變的確認(rèn)，方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果易于觀察，適合于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢驗(yàn)。

3 培養(yǎng)法

通過(guò)選擇性的在顯色培養(yǎng)基中加入碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物篩選產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌。Panagea等[9]比較CHROMagar KPC與加亞胺培南麥康凱培養(yǎng)基篩選產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果,其陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值分別為CHROMagar 100.0%和98.8%，亞胺培南麥康凱培養(yǎng)基94.7%和88.6%。盡管bla(KPC)和bla(VIM)在CHROMagar上無(wú)法從顏色或菌落形態(tài)進(jìn)行區(qū)分，但CHROMagar KPC是一個(gè)有效的篩選培養(yǎng)基，適用于糞便中篩選各種產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科。一種包含厄他培南、氯唑西林、硫酸鋅的培養(yǎng)基(SUPERCARBA)能篩選出(除OXA-163外)OXA-48、NDM、VIM、IMP 和KPC腸桿菌科細(xì)菌，(1～3)×10 cfu/100 mg的濃度就能檢出，敏感性比ChromID ESBL (bioMérieux)和CHROMagar KPC (CHROMagar)都高[10]。SUPERCARBA培養(yǎng)基能有效提高檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶(多數(shù)常見(jiàn)類(lèi)型)腸桿菌的能力，更廣范圍檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶任何類(lèi)型。ID Carba是一種新顯色培養(yǎng)基，在檢測(cè)NDM-1比Colorex KPC更敏感,有可能作為篩查NDM-1的篩選培養(yǎng)基[11]。

4 生物化學(xué)方法

4.1 Carba NP test[12]Patrice Nordmann研發(fā)了Carba NP test，采用細(xì)菌細(xì)胞裂解后的酶粗提物與亞胺培南進(jìn)行反應(yīng)，碳青霉烯酶能水解碳青酶烯類(lèi)抗菌藥物，使其開(kāi)環(huán)伴H+產(chǎn)生，一定濃度H+可使檢測(cè)液中的酚紅指示劑變色，根據(jù)顏色變化進(jìn)行判斷，推測(cè)菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶，根據(jù)不同酶抑制劑進(jìn)一步確定產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的組別。通過(guò)生化反應(yīng)能較好區(qū)分碳青霉烯類(lèi)耐藥菌株的耐藥機(jī)制。Carba NP對(duì)大多數(shù)產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌在15～30 min可檢出，Carba NP 100% 的OXA-48、KPC、IMP能被檢出(無(wú)論非選擇培養(yǎng)基還是選擇培養(yǎng)基)，VIM、NDM只能從補(bǔ)充鋅Mueller-Hinton瓊脂被檢出。Dortet等[13]研究表明鋅離子濃度是Carba NP檢測(cè)VIM、NDM-1的關(guān)鍵。Carba NP 還可用于直接檢測(cè)血培養(yǎng)細(xì)菌、培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落及臨床標(biāo)本，但陽(yáng)性、陰性預(yù)測(cè)值有待評(píng)估。該試驗(yàn)與分子生物學(xué)技術(shù)比較，敏感性、特異性均為100%，2 h可獲得結(jié)果，經(jīng)濟(jì)實(shí)用且不需要其他技術(shù)，可在醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室日常實(shí)施。

4.2 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)方法[14]將細(xì)菌菌液加入到含美羅培南十二烷基硫酸鈉Tris-Hcl-Nacl緩沖液中，35 ℃孵育2 h，1 μL上清液與1 μL二甲基苯甲酸混合后進(jìn)行MALDI-TOFMS檢測(cè)，產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌由于可以水解美羅培南出現(xiàn)358.5、380.5 m/z質(zhì)譜峰，不出現(xiàn)384.5、406.5 M/Z質(zhì)譜峰，非產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌則相反，通過(guò)質(zhì)譜峰的變化可以鑒定產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌。MALDI-TOFMS法與PCR、測(cè)序法、分光光譜測(cè)量法結(jié)果高度一致，無(wú)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果。該法可快速、準(zhǔn)確直接檢測(cè)酶活性，其不僅可以作為鑒定依據(jù)還可以用于耐藥機(jī)制分析，但是要注意標(biāo)本晾干后立即用質(zhì)譜儀測(cè)定，如耽擱1 h后會(huì)引起美羅培南降解而變異。

4.3 二氧化硅磁珠法[15]用二氧化硅磁珠快速裂解產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌，檢測(cè)提取物對(duì)亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶水解活性，根據(jù)酶底物特異性和EDTA、克拉維酸抑制不同碳青霉烯酶的特點(diǎn)，快速區(qū)分絲氨酸碳青霉烯酶和金屬碳青霉烯酶。

4.4 分光光度計(jì)法 分光光度計(jì)檢測(cè)碳青霉烯酶的水解作用是檢測(cè)可疑菌株碳青霉烯酶產(chǎn)生的參考方法。分別檢測(cè)細(xì)菌粗提物或部分純化酶加抑制劑和不加抑制劑，對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物水解前后的吸光度，檢測(cè)酶的活性。這種方法能夠獲取酶型，但必須在參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

5 免疫層析法[16]

根據(jù)金屬酶抗原表位的單克隆抗體建立免疫層析法可以直接檢測(cè)碳青霉烯類(lèi)不敏感的IPM β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌和非發(fā)酵菌，免疫層析法直接檢測(cè) IMP-MBLs(包括IMP-1、-2、-6、-7、-10、-11、-19、-20、-22、-40、-41、-42新型),IMP-MBLs通過(guò)與雙紙片增效試驗(yàn)、MBL E-test、MTH比較，PCR證實(shí)，敏感性、特異性均為100%，有關(guān)試驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)于 IMP-MBLs免疫層析法有可能替代PCR。

6 分子生物學(xué)方法

6.1 PCR法 包括普通PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)PCR、分子信標(biāo)多重實(shí)時(shí)PCR，PCR技術(shù)采用基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序，可以檢測(cè)細(xì)菌是否具有碳青霉烯酶基因，多重PCR技術(shù)通過(guò)在1個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異引物可以在1次反應(yīng)中檢測(cè)多種目的基因。van der Zee等[17]采用多重實(shí)時(shí)PCR準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)Carbapenemases bla OXA-48、blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaKPC,而且適用于篩選肉湯培養(yǎng)或直腸拭子和臨床標(biāo)本。實(shí)時(shí)熒光定量PCR用熒光定量探針對(duì)所有blaKPC進(jìn)行擴(kuò)增，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物被BstNⅠ和RsaⅠ進(jìn)行酶切消化分析以區(qū)分blaKPC1-3型基因。分子信標(biāo)多重實(shí)時(shí)PCR根據(jù)熒光強(qiáng)度和熒光類(lèi)型能檢測(cè)出blaKPC-2～blaKPC-11,有學(xué)者報(bào)道用分子信標(biāo)多重實(shí)時(shí)PCR可檢測(cè)NDM-1基因。與常規(guī)PCR相比較，分子信標(biāo)多重實(shí)時(shí)PCR可以進(jìn)行閉管操作，有效消除核酸交叉污染，具有實(shí)時(shí)、定量、高靈敏度、高特異性特點(diǎn)。在臨床應(yīng)用中PCR 法是檢測(cè)碳青霉烯酶基因的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于需要特殊儀器設(shè)備，費(fèi)用昂貴，不適合臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，另外其也無(wú)法檢測(cè)細(xì)菌大量耐藥的機(jī)制和碳青霉烯類(lèi)耐藥的其他機(jī)制。

6.2 核酸微陣列法[18]PCR是最廣泛使用的分子技術(shù)，然而這些方法仍然耗時(shí)。核酸微陣列法從提取DNA到結(jié)果報(bào)告僅需7～8 h。Check-MDR CT102微陣列除了檢測(cè)KPC、OXA-48、VIM、IMP、NDM-1碳青霉烯酶基因，還可檢測(cè)TEM、SHV、CTX-M ESBLs，blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48基因，其特異性和敏感性都為100.0%,而blaKPC基因分別為100.0%和85.0%。blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48基因,陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值都是100.0%，blaKPC基因的陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值分別為100.0%和98.0%。核酸微陣列可區(qū)分同一分離株中產(chǎn)碳青霉烯酶基因及ESBLs、AmpC、膜孔蛋白缺失，但對(duì)于不動(dòng)桿菌(OXA-23、OXA-24、OXA-58)可能會(huì)漏檢，無(wú)法檢測(cè)少見(jiàn)的PER、GES、VEB、BEL-1、ESBLs，無(wú)法區(qū)分各種酶亞型。

6.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) Notomi首先提出了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其利用一種具有鏈置換反應(yīng)DNA聚合酶和2對(duì)特殊引物，對(duì)靶序列上的6個(gè)特異序列進(jìn)行特異擴(kuò)增,在65 ℃的等溫條件下反應(yīng)1 h即可將靶序列DNA擴(kuò)增109～1010倍,產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的白色焦磷酸鎂沉淀。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增與PCR比較，檢測(cè)bla(NDM-1)和bla(KPC)具有更大的敏感性和特異性且快速，NDM-1陽(yáng)性參考菌株基因組每管1 pgDNA檢出[19]。345份臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示,與PCR檢測(cè)結(jié)果100%的一致,其中3個(gè)受污染的標(biāo)本被正確檢出,PCR卻不能，但其高敏感性可能造成假陽(yáng)性導(dǎo)致應(yīng)用受到一定的限制[20]。

7 結(jié) 語(yǔ)

產(chǎn)碳青霉烯酶是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要原因。碳青霉烯酶的檢測(cè)方法主要有耐藥菌篩選、表型確認(rèn)、基因水平分析等，效能各有利弊，而快捷、方便、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有待進(jìn)一步研究。臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)流行病學(xué)資料制定統(tǒng)一的適合該地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，將碳青霉烯酶檢測(cè)作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)項(xiàng)目，可最大限度地發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，為臨床提供快速、準(zhǔn)確的信息，針對(duì)性地進(jìn)行抗菌治療和控制產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的傳播，防止該類(lèi)病原菌的擴(kuò)散，有效控制醫(yī)院感染的發(fā)生。

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廣西醫(yī)藥衛(wèi)生自籌經(jīng)費(fèi)計(jì)劃課題(Z2014152)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.12.060

A

1672-9455(2015)12-1798-03

2014-12-22

2015-02-15)