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代謝組學在輻射損傷研究中的應用

郭明星，吳誠，童衛(wèi)杭

[作者單位] 100088 北京，第二炮兵總醫(yī)院藥學部

[關鍵詞]輻射損傷; 代謝組學; 機制研究; 生物標志物

隨著核能及放射技術在各領域的廣泛應用，人們的工作和日常生活不可避免的會接觸輻射，輻射造成的損傷也日益受到關注。輻射流行病學調查發(fā)現(xiàn)，長期低劑量輻射會出現(xiàn)頭暈、乏力、記憶力減退等癥狀[1-5]，大劑量輻射會造成造血、胃腸、神經(jīng)血管和皮膚等一個或多個系統(tǒng)損傷，引起神經(jīng)、內分泌等系統(tǒng)調節(jié)障礙，破壞機體組織的蛋白質、核酸和酶等引起機體物質代謝紊亂[6-7]。輻射損傷是多層次、多步驟、多階段的復雜過程[8]，目前迫切需要對其損傷機制和早期診斷進行研究。

代謝組學是指通過考察生物體系(細胞、組織或生物體)受刺激或擾動后(如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后)，其代謝產物(內源性代謝物質)種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的學科[9]。目前輻射損傷在基因水平和細胞水平已經(jīng)進行了廣泛的研究，但由于其損傷的復雜性和終端表象的差異性，對輻射損傷的研究仍沒有突破性進展?；谳椛鋼p傷最終都會導致終端代謝物的一系列變化，通過代謝組學技術在整體代謝水平上研究輻射損傷的發(fā)生、發(fā)展機制，有助于我們發(fā)現(xiàn)可用于輻射損傷早期診斷、療效評估和預后的標志物。本文就近年代謝組學在輻射損傷中的研究做一綜述。

1代謝組學研究方法

代謝組學研究流程主要包括樣品采集與前處理、數(shù)據(jù)的采集和數(shù)據(jù)分析3個步驟。1.1代謝組學樣品采集與前處理代謝組學的研究對象廣泛，目前對體液(血液、尿液、腦脊液等)，組織，細胞培養(yǎng)液等的樣品采集和前處理均發(fā)表了相關操作規(guī)程[10-14]。其中應用于輻射損傷的研究樣本多為尿液和血液(血清和血漿)。研究學者通常根據(jù)檢測代謝物個數(shù)的不同將代謝組學分為靶標代謝組學和非靶標代謝組學[15]。靶標代謝組學是指一定數(shù)量的代謝物的定性、定量分析;非靶標代謝組學是指無偏見的測量和比較盡可能多的代謝物。目前對于輻射代謝組學的研究大部分局限于非靶標代謝組學機制探索階段，進一步的靶標代謝組學生物標志物驗證研究仍存在不足。

1.2代謝組學數(shù)據(jù)采集技術目前，代謝組學研究主要的數(shù)據(jù)采集技術為基于核磁共振光譜(NMR)和質譜(MS)的檢測技術。其中應用最廣的為NMR、液相色譜質譜連用(LC-MS)和氣相色譜和質譜連用(GC-MS)技術，各類檢測技術均有其優(yōu)缺點。代謝組學是基于NMR技術發(fā)展起來的一門學科，NMR對生物樣品的選擇寬泛，不需要復雜的樣品前處理，對樣品無破壞性，檢測無偏向性，但對酸堿度、離子濃度、溫度都很敏感，分析靈敏度低、譜圖重疊相互干擾，導致圖譜解析困難。GC-MS是分析揮發(fā)性化合物的一種高效技術，適用于GC-MS分析的化合物必須是可揮發(fā)的或是經(jīng)過衍生化可揮發(fā)的化合物。GC-MS分析速度快，靈敏度高的特點有利于微量物質的分析，較高的柱效加上合適的梯度升溫可以將絕大多數(shù)的峰形加以分離以用于定量;以較完整的譜庫為基礎的結構分析軟件為未知物質的定性提供了極大的便利。GC-MS技術最大的缺陷是往往需要對樣品進行預處理，對生物樣品中的原始信息造成了干擾，不利于代謝組學的“全譜”分析。LC-MS相對于GC-MS可以分析較高極性和較大分子量的化合物，并且樣品無需衍生化處理。隨著超高效液相色譜(UPLC)和高分辨質譜(Q-TOF/MS和LTQ/Orbitrap等)的出現(xiàn)，為復雜生物樣品提供了更好的分離能力和結構鑒定能力。目前，有些研究常采用多種技術進行聯(lián)合檢測，進行分析方法的整合，來提高檢測數(shù)據(jù)的全面性。

1.3代謝組學數(shù)據(jù)分析技術代謝組學的數(shù)據(jù)分析一般包括:數(shù)據(jù)預處理、模式識別、代謝物鑒定和生物標志物驗證。數(shù)據(jù)預處理主要包括濾噪、峰識別、重疊峰解析、峰對齊、峰補齊和歸一化等。經(jīng)過數(shù)據(jù)預處理后，得到的二維數(shù)據(jù)矩陣用于模式識別。模式識別包括無監(jiān)督學習方法和有監(jiān)督學習方法。無監(jiān)督學習方法是將所得分類信息和樣品的原始信息比較，找出差別，其不需要任何有關樣本類別的知識，直接從己有數(shù)據(jù)中獲得樣本的類別歸屬。主要包括:主成分分析，層次聚類分析，自組織圖、聚類分析。有監(jiān)督學習方法是利用多參數(shù)模型對樣品進行識別和分類，其需要事先獲得樣本的分類信息，利用已知類別的樣本作為訓練數(shù)據(jù)建立和優(yōu)化有關分類模型，以對后續(xù)新樣本的類別進行預測。主要包括:判別分析、偏最小二乘法、偏最小二乘- 判別分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡等。

2代謝組學在輻射損傷研究中的應用

輻射是由不同能量的電磁波尤其是χ、γ射線等高能電磁波，α、β粒子、超熱中子等放射性粒子以及鈾、氡、钚等放射性同位素引起的一種能量傳遞方式[16]。通常根據(jù)輻射頻率及作用形式分為電離輻射和非電離輻射。電離輻射是指能引起被作用物質電離的輻射。對于生物組織來說，電離輻射的危害性很大，由于造成危害的主要是量子能量，而不是總能量，因此，即使在低功率照射下，也會產生累積效應，造成生物組織的破壞與損傷。非電離輻射一般不引起物質分子的電離，只導致分子的振動、轉動或電子能激狀態(tài)的改變，因此非電離輻射的量子能量不足以破壞分子，它對生物體的破壞與損傷，取決于其總能量，即必須在高功率和一定的照射時間下才能發(fā)生。非電離輻射會使生物體在沒有明顯升溫的條件下，導致神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等功能紊亂。目前代謝組學在輻射損傷的研究大都集中于電離輻射損傷，對非電離輻射損傷研究較少。

2.1代謝組學在電離輻射研究中的應用γ射線輻射生物體后，生物機體產生自由基，當自由基產生過多而不能及時清除時就會引起一系列的輻射損傷[17-20]。四氫生物蝶呤(BH4)是一氧化氮合酶(NOS)的重要輔助因子。其缺乏將導致NOS解耦聯(lián)，生成自由基O2-，O2-能與NO反應，生成ONOO-，ONOO-是一種很活潑的陰離子，可以破壞酶的結構和功能，引起細胞損傷。有研究者采用代謝組學技術研究了非致死劑量的電離輻射在過表達GTPH-1 反饋調節(jié)蛋白的轉基因小鼠肝組織中的代謝情況[21-22]，發(fā)現(xiàn)BH4的相對含量在輻射組明顯較低，并發(fā)現(xiàn)了一系列與氧化應激和脂質過氧化有關的代謝物。Ahmad等[23]采用1HNMR對γ射線輻射的小鼠尿液和血清進行代謝組學分析，在5Gy照射后的小鼠尿液中，檸檬酸鹽、α-酮戊二酸、丁二酸、馬尿酸、三甲胺與非照射組相比具有明顯差異，通過相關的代謝路徑分析發(fā)現(xiàn)γ射線輻射擾亂了腸道微生物菌群的生長和機體能量代謝，血清研究還發(fā)現(xiàn)γ射線輻射損傷與脂質代謝、能量代謝紊亂有關。

機體受到輻射作用后，血細胞的增殖、分裂功能下降，血細胞來源減少，白細胞下降，骨髓造血功能障礙[24]?；诖?，采用γ射線全身大劑量照射可建立血虛證模型?；舫萚25]采用60Coγ射線3．5Gy照射劑量全身1次性照射小鼠建立小鼠血虛證模型，并以四物湯連續(xù)7d灌胃給藥進行干預。采用NMR技術檢測血清、胸腺、脾臟以及股骨上段骨髓組織提取液觀察其代謝譜的變化。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、肌酐、磷酸化膽堿、膽堿、肌酸、乳酸、低密度脂蛋白等在正常組與輻射損傷所致血虛證組代謝波動較大，給予四物湯干預后相關化合物具有轉歸趨勢。輻射損傷所致血虛證的機制可能與機體無氧氧化功能受損、能量代謝和脂類代謝失調、細胞內外滲透壓平衡受到破壞以及機體免疫功能失調有關。IdleJR課題組對γ射線輻射生物標志物進行了一系列系統(tǒng)研究。該課題組首先采用兩個強度的γ射線(3Gy和8Gy)照射小鼠，收集小鼠照射前和照射后24h的尿液進行UPLC-Q-TOF/MS代謝組學分析。研究發(fā)現(xiàn)尿液中胸苷的相對含量在γ射線照射組明顯高于非照射組[26]。隨后，該課題組又進一步研究了γ射線低劑量照射(1Gy，2Gy，3Gy)小鼠尿液代謝輪廓隨強度的變化。研究發(fā)現(xiàn)，包括胸苷和2＇-脫氧尿苷在內的脫氨嘌呤類和嘧啶類具有照射劑量和照射時間相關性[27]?？紤]到尿液中一些高極性化合物在UPLC系統(tǒng)中不保留不易分離，該課題組又采用GC-MS方法對γ射線照射的大鼠尿液代謝產物進行了分析，發(fā)現(xiàn)尿液中乙醛酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶、檸檬酸鹽、2-酮戊二酸等的相對含量在照射組與非照射組明顯不同。胸腺嘧啶和尿嘧啶由于是胸苷和2＇-脫氧尿苷的衍生物，與前期研究結果具有一致性。通過代謝路徑分析發(fā)現(xiàn)，γ射線照射可能影響機體氧化應激和腎功能水平[28-30]。通過UPLC-QTOF/MS大鼠尿液代謝組學分析，又進一步證實了上述化合物作為γ射線輻射損傷嚙齒類動物生物標志物的可能性[31]。為了進一步的將嚙齒類實驗數(shù)據(jù)與臨床研究相關聯(lián)，該課題組又對靈長類動物獼猴進行尿液輻射代謝組學研究[32]。研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸、黃嘌呤、尿酸、肌酐等13個化合物對聚類貢獻明顯，并對這些化合物進行了進一步的靶標代謝組學研究，明確了其在輻射組與對照組之間的含量差異，并通過受試者工作特征曲線(ROC曲線)評估了其模型判別的準確性。然而在對前期潛在標志物進行靶標代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，這些化合物均沒有顯著差異，分析結果一方面可能是由于物種之間差異的影響，另一方面提示我們非靶標代謝組學查找到的生物標記物需進一步經(jīng)過定量驗證來評估其準確性。

2.2代謝組學在非電離輻射研究中的應用隨著微波技術的廣泛應用，微波輻射作為非電離輻射的常見形式也逐漸得到關注。長期受到微波輻射的人員會出現(xiàn)精神抑郁、失眠、疲勞、頭痛、激動、多夢、記憶力下降等癥狀[33]。王麗峰等[34]采用NMR代謝組學研究了微波輻射對獼猴尿液中代謝產物的影響。經(jīng)5和11mM/cm2微波單次輻射和4．68μW/cm2微波30d累積輻射均能引起尿液代謝產物的變化，其差異代謝物包括馬尿酸、檸檬酸、乳酸、甘氨酸、肌酸、肌酐、?；撬岷捅奖彼岬?。這些代謝物質涉及三羧酸循環(huán)中間產物、氨基酸遞質代謝產物等，其功能主要涉及線粒體、神經(jīng)遞質等，提示低劑量微波長期輻射和高劑量微波一次性輻射均對機體代謝產生影響。

3展望

代謝組學應用于輻射損傷的研究還處于初級階段，仍然有許多問題需要解決。從近幾年輻射代謝組學相關文獻來看，代謝組學在輻射損傷中的研究，大多集中于生物標志物的探索階段，在機制研究方面仍比較欠缺。從代謝組學的研究手段上來說，絕大部分仍停留在非靶標代謝組學的輪廓分析，對生物標志物的靈敏度與準確性沒有進行進一步的定量驗證，從而缺乏有的效說服力。同時，從上述分析中還可以發(fā)現(xiàn)，研究者沒有將代謝組學數(shù)據(jù)與病理生理學研究結果進行有效的結合，在造模階段缺乏有效的病理學數(shù)據(jù)進行支撐，在生物標志物驗證過程，缺乏對差異化合物的波動原因進行有效闡釋。但代謝組學在輻射損傷研究中全面、高通量、無偏差的優(yōu)勢不容忽視，隨著研究的不斷深入和代謝組學分析方法的不斷規(guī)范，上述問題終將得到解決。代謝組學技術將在輻射損傷的診斷和機制研究以及輻射損傷防治藥物研究中發(fā)揮積極作用，推動放射醫(yī)學的發(fā)展。

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(收稿時間:2015-09-20 修回時間:2015-10-20)

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號] R818.74 A

[文章編號]2095-140X(2015) 12-0113-04

[通訊作者]童衛(wèi)杭，E-mail:sonatawh@163.com

[基金項目]全軍醫(yī)學科技青年培育項目(14QNP072)

[DOI]10.3969 /j.issn.2095-140X.2015.12.026