石勝利，戴小華，馬婭梅，周海華

(中山小欖人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 中山 528415)

芬維A胺對人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖與細(xì)胞凋亡的影響

石勝利，戴小華，馬婭梅，周海華

(中山小欖人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 中山 528415)

目的探討分子靶向藥物芬維A胺(Fenretinide)在體外對人肝癌細(xì)胞株HepG2的細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的影響。方法體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)液中加入不同濃度的芬維A胺(2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L)，對照組培養(yǎng)液中不加芬維A胺，分別孵育48 h后，采用MTT法檢測芬維A胺對HepG2細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡率。結(jié)果芬維A胺能明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖，呈時間和劑量依賴性；芬維A胺處理HepG2細(xì)胞72 h，可使G0～G1期細(xì)胞比例升高，G2～M、S期比例明顯下降，凋亡率明顯上升(P＜0.05)。結(jié)論芬維A胺對體外人肝癌HepG2細(xì)胞具有明顯的抑制作用，主要表現(xiàn)為抑制增殖和促進(jìn)凋亡。

芬維A胺；人肝癌細(xì)胞株HepG2；細(xì)胞增殖；凋亡

我國的原發(fā)性肝癌患者多數(shù)伴有嚴(yán)重肝硬化和肝功能失代償，而且相當(dāng)部分的肝癌為多中心發(fā)生，臨床診斷時已多屬進(jìn)展期，多數(shù)已失去手術(shù)機(jī)會。全身化療仍是治療這類肝癌的主要手段之一，但肝癌對常規(guī)化療藥物不敏感，預(yù)后極差[1]，因此迫切需要尋找新的治療方法。隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制細(xì)胞分子水平的深入研究，腫瘤分子靶向治療成為近年來抗癌藥物研究的熱點(diǎn)，被認(rèn)為是提高肝癌治療效果的希望所在[2]。芬維A胺可有效用于多種腫瘤的預(yù)防，其相對于傳統(tǒng)化療藥物具有特異性強(qiáng)、副作用少和具有協(xié)同作用等特點(diǎn)，能作用于多個信號傳導(dǎo)通路和不同靶點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制新生血管形成等靶向抗癌活性，可長期服用，是一種具有良好臨床應(yīng)用前景的靶向抗癌藥物[3]。本實(shí)驗(yàn)觀察了芬維A胺在體外對人肝癌細(xì)胞株HepG2的抑制作用，以期為臨床分子靶向藥物治療肝癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 芬維A胺購自湖北賽博藥業(yè)有限公司，將芬維A胺溶于二甲基亞砜(DMSO)原液并稀釋成10mmol/L儲存液，-20℃避光儲存?zhèn)溆?，DMSO終濃度＜0.5%。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma公司，用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成濃度為5 mg/ml。碘化丙錠(PI)試劑盒購自Sigma公司。Annexin V-EGFP試劑盒和人肝癌細(xì)胞株HepG2購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞置于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中，在含10%胎牛血清及青霉素G (100 unit/ml)和鏈霉素(1μg/ml)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中生長。貼壁生長的細(xì)胞以0.25%的胰蛋白酶消化，每2～3 d傳代一次。

1.3 MTT法測定芬維A胺對HepG2細(xì)胞的抑制率 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，消化制成單細(xì)胞懸液后，以1×105/ml密度接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組每孔加細(xì)胞懸液100 μL，空白孔不加細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后加入藥物。使藥物組每孔芬維A胺終濃度分別為2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L，陰性對照組與空白調(diào)零組只加培養(yǎng)基，每組設(shè)6個平行對照孔。置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，72 h后棄上清，每孔加MTT(1 mg/ml)100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去原培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl/孔，振蕩10min，用酶標(biāo)儀測定吸光度(A)，測定波長540 nm，參考波長620 nm，計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值)×100。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布及凋亡 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后接種于培養(yǎng)瓶，每瓶加培養(yǎng)液8ml。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇的劑量加藥后，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后加入藥物，實(shí)驗(yàn)分為芬維A胺(10 μmol/L)組和對照組。加藥72 h后分別收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞周期及凋亡率檢測：(1)細(xì)胞周期檢測：細(xì)胞用75%酒精固定24 h，PBS沖洗后PI染色，避光室溫反應(yīng)30min，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；(2)凋亡率檢測：調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105/ml，加入Annexin V-EGFP 5 μl和5 μl PI，避光室溫反應(yīng)15min后檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 芬維A胺對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT法測定結(jié)果顯示，芬維A胺對HepG2細(xì)胞增殖有抑制作用，呈現(xiàn)濃度和時間依賴關(guān)系。2.5 μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20 μmol/L均為有效藥物濃度。隨用藥時間的延長，抑制率明顯上升(P＜0.05)；隨用藥濃度的提高，抑制率逐漸升高，但10μmol/L與20μmol/L濃度作用48 h后，其抑制率即可達(dá)到50%以上，見表1。

表1 芬維A胺作用于HepG2細(xì)胞的抑制率(±s)

表1 芬維A胺作用于HepG2細(xì)胞的抑制率(±s)

芬維A胺(μmol/L)作用時間t值P值48 h 72 h 2.5 5 10 20 26.17±0.94 32.91±3.35 41.08±3.41 44.93±6.36 35.50±1.18 40.90±3.34 53.41±3.65 56.78±2.50 10.648 2.920 3.955 3.001 0.000 0.043 0.016 0.040

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡率 芬維A胺處理72 h，HepG2細(xì)胞周期中的G0～G1期比例明顯升高，從(40.67±0.57)%上升到(66.58±0.65)%，G2～M期比例從(15.43±0.58)%下降到(8.32±0.02)%；S期比例從(26.60±1.57)%下降到(14.38±1.21)%。凋亡率從(3.45±0.23)%上升到(19.08±1.35)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 芬維A胺處理72 h后HepG2細(xì)胞周期比例和凋亡率(%，±s)

表2 芬維A胺處理72 h后HepG2細(xì)胞周期比例和凋亡率(%，±s)

組別G0～G1期G2～M期S期 凋亡率40.67±0.57 66.58±0.65 51.307 0.000對照組芬維A胺t值P值15.43±0.58 8.32±0.02 20.952 0.000 26.60±1.57 14.38±1.21 10.619 0.000 3.45±0.23 19.08±1.35 19.684 0.000

3 討 論

芬維A胺是在全反式維甲酸的基礎(chǔ)上經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造而成的維甲酸類似物，是目前已知毒副作用最小的維生素類化合物，能夠抑制致癌物所誘導(dǎo)的多種腫瘤，并能誘導(dǎo)實(shí)體腫瘤如乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膀胱癌以及頭頸部等腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，在實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療上顯示出較強(qiáng)的抗癌活性，可以預(yù)防乳腺癌和卵巢癌的術(shù)后復(fù)發(fā)，但不損傷正常肝細(xì)胞等[4-5]，其主要作用于腫瘤細(xì)胞，增大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，從而啟動一系列通路，抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。芬維A胺還可用于脂肪肝和肝纖維化的預(yù)防和治療，研究顯示給高脂飲食喂養(yǎng)小鼠服用芬維A胺可以改善小鼠肝內(nèi)胰島素抵抗從而預(yù)防脂肪肝。芬維A胺能誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化[6-7]。因此，芬維A胺可逆轉(zhuǎn)肝臟早期病理變化可用于肝癌的預(yù)防。

本實(shí)驗(yàn)通過MIT法發(fā)現(xiàn)芬維A胺對肝癌HepG2細(xì)胞株的增殖有明顯的增殖抑制作用。呈現(xiàn)濃度和時間依賴關(guān)系。隨著芬維A胺濃度的增加和作用時間的延長，對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率逐漸上升，說明它的抑制作用具有一定的劑量和時間依賴性。芬維A胺濃度從10μmol/L到20μmol/L作用48 h后，其抑制率即可達(dá)到50%以上，再無明顯上升。

芬維A胺可以將肝癌HepG2細(xì)胞的周期阻滯在G0～G1期，G0～G1期細(xì)胞比例從(40.67±0.57)%上升到(66.58±0.65)%，導(dǎo)致G0～G1期細(xì)胞比例增加，而進(jìn)人S期的細(xì)胞比例減少，從而阻斷了細(xì)胞的生長和分裂，延長了細(xì)胞周期，起到抗增殖作用。

本研究發(fā)現(xiàn)10μmol/L芬維A胺能明顯誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈時間依賴性。細(xì)胞凋亡率凋亡率從(3.45±0.23)%上升到(19.08±1.35)%，這個結(jié)果與Yang等[8-9]的報(bào)道相符，以人肝癌細(xì)胞株來檢測芬維A胺對肝癌細(xì)胞的敏感性，發(fā)現(xiàn)芬維A胺顯著誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株凋亡，這一凋亡效應(yīng)與芬維A胺抑制ERK1/2通路活性促使Nur77出核誘導(dǎo)凋亡有關(guān)，但人肝癌細(xì)胞株耐受芬維A胺是因?yàn)镋RK1/2-Nur77凋亡通路受抑制有關(guān)。并且也與其他芬維A胺誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的研究相似。國內(nèi)吳小琴等[10]的研究結(jié)果顯示在對芬維A胺不敏感的肝癌細(xì)胞株SNU475、 SNU449、SNUl82中，芬維A胺上調(diào)P-ERKl/2蛋白表達(dá)，而在敏感細(xì)胞SK-HEP-1、PLC/PRF/5中，芬維A胺下調(diào)P-ERKl/2蛋白表達(dá)，提示芬維A胺體外促肝癌細(xì)胞凋亡可能通過抑制ERKl/2蛋白活化起作用。同時芬維A胺對HepG2細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)也存在濃度依賴性，隨著作用濃度的增加，其凋亡效應(yīng)也隨之增加。由此可見，芬維A胺作為腫瘤預(yù)防性藥物對于癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)。

芬維A胺作為一種抗腫瘤分子靶向新藥，與化療藥物相比其毒副作用較小，如與化療藥物聯(lián)用能增強(qiáng)療效，因此具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。但芬維A胺抑制腫瘤的具體機(jī)理尚未完全清楚，鑒于細(xì)胞內(nèi)信號傳遞途徑十分復(fù)雜，更確切的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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Effect of fenretinide on the proliferation and apoptosis of human liver cancer cell line hepG2.

SHI Sheng-li,DAI Xiao-hua,MA Ya-mei,ZHOU Hai-hua.Department of Gastroenterology,Zhongshan Xiaolan People's Hospital, Zhongshan 528415,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the depressant effects of fenretinide on human liver cancer cell line HepG2 cellsin vitro.MethodsHuman liver carcinoma line HepG2 cells were culturedin vitro.The HepG2 cells of the test group were incubated in the medium with fenretinide at different concentrations(2.5 μmol/L,5 μmol/L,10 μmol/L, 20 μmol/L).The cells of the control group were incubated in the medium for 48 hours.MTT method was used to detect the antiproliferative ratio of fenretinide on HepG2 cells,and flow cytometry was applied to analyze the cell cycle and apoptotic ratio.ResultsFenretinide could obviously inhibit the proliferation of HepG2 cells,showing time-and dose-dependent effects.72 hours after the HepG2 cells were treated with fenretinide,the percentage of HepG2 cells in G0~G1period increased,and that in G2～M period and S period decreased,with the aopototic ratio of HepG2 cells increased significantly(P＜0.05)．ConclusionFenretinide can inhibit proliferation and promote apoptosis of human liver cancer cell line HepG2 cellsin vitro．

Fenretinide;Human liver cancer cell line HepG2;Cell proliferation;Apoptosis

R735.7

A

1003—6350（2013）04—0472—03

2014-07-09)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.04.0173

2012中山市科技局立項(xiàng)課題(編號：20122A106)

石勝利。E-mail：shishengli2004@163.com